Ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética para la detección de complejos de factor de transcripción-ADN

Resumen

Fuente: Hsieh, Y. W. et al., Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo. J. Vis. Exp. (2016)

En este video, demostramos el ensayo de cambio de movilidad electroforética para detectar interacciones proteína-ADN utilizando sondas de ADN marcadas con fluorescentes infrarrojos. Cuando la proteína se une a la sonda de ADN, forma un gran complejo que migra lentamente y aparece como una banda desplazada en el gel.

Protocolo

1. Reacción de unión y electroforesis

1. Prepare 1 mL de tampón de unión 5x mezclando 50 μL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 10 μL de NaCl 5 M; 200 μL de KCl 1 M, 5 μL de 1 M MgCl₂, 10 μL de EDTA 0,5 M, pH 8,0; 5 μL de DTT 1 M; 25 μL de 10 mg/mL de BSA, y 695 μL de ddH₂O.
   nota: El tampón de unión 5x se puede alícuota y almacenar a -20 °C. Otro punto a tener en cuenta es que los diferentes factores de transcripción tendrán diferentes modificaciones en el tampón de unión.
2. Justo antes de configurar las reacciones de unión, preejecute el gel de poliacrilamida nativa al 5% en 0,5x TBE + 2,5% de glicerol para eliminar todos los rastros de persulfato de amonio a 80 V durante 30 - 60 min, o hasta que la corriente ya no varíe con el tiempo.
3. Configure la reacción de unión en el volumen final de 20 μL.
   1. Mezcle 4 μL de tampón de unión 5x, 80 - 200 ng de proteína A purificada (en glicerol al 50%, es decir, SOX-2), 1 μL de sonda conjugada con colorante de 0,1 μM (concentración final: 5 nM) y ddH₂O.
   2. Opcional: Cuando se requieran competidores de sondas frías, agregue varias concentraciones (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) de sondas frías.
   3. Opcional: Cuando se pruebe la interacción entre las proteínas A y B (es decir, SOX-2 y LIM-4), agregue de 80 a 200 ng de proteína B purificada (en glicerol al 50%, es decir, LIM-4).
   4. Opcional: Cuando se utilice la preparación de extracto nuclear y se vaya a validar la unión específica de la proteína A, se añada un anticuerpo específico contra la proteína A (es decir, anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
   5. Incubar a R/T en la oscuridad durante 15 min.
4. Cargue todas las reacciones de unión en el gel y haga funcionar el gel a 10 V/cm a la distancia deseada.

2. Imágenes

NOTA: El gel se escaneó directamente en las placas de vidrio con un avanzado sistema de imágenes infrarrojas. Por lo tanto, el gel puede resolverse más y escanearse repetidamente (Figuras 1C y 2). También se probó un sistema de imágenes fluorescentes de infrarrojo cercano, principalmente para Western blots, para escanear el gel, pero solo el avanzado sistema de imágenes infrarrojas pudo escanear el gel con buena resolución. La metodología descrita es específica de un software de imágenes infrarrojas en particular, aunque se pueden utilizar otros paquetes de software.

1. Limpie la base del escáner con ddH₂O y séquela bien antes de escanear. Seque las placas de vidrio del gel y coloque las placas que contienen el gel en la base del escáner.
2. Abra el software de imágenes infrarrojas y vaya a la pestaña 'Adquirir'. Cuando se coloque la placa más delgada (1 mm) en la base del escáner, utilice los ajustes de Canal: 700, Intensidad: Automático, Resolución: 169 μm, Calidad: media y Desplazamiento de enfoque: 1,5 mm. Cuando se coloque la placa más gruesa (3 mm) en la cama del escáner, utilice los ajustes de Canal: 700, Intensidad: Automático, Resolución: 84 μm, Calidad: media y Desplazamiento de enfoque: 3,5 mm. El desplazamiento del enfoque depende del grosor de la placa de vidrio.
3. Seleccione el área que ocupa el gel en el escáner. Haga clic en 'Iniciar' para comenzar el escaneo.

Resultados

Figura 1. fEMSA utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo. (A) Diagrama de flujo de fEMSA. (B) El efecto del colorante azul de bromofenol, naranja G y dI-dC (1 μg) sobre fEMSA. Se utilizaron 5 nM de la sonda 5'Dye-LIM-4/SOX-2. (C)fEMSA que muestra la especificidad de unión de 6xHis-SOX-2^G73E al sitio objetivo de SOX-2 del elemento LIM-4/SOX...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de acrilamida/Bis al 30%, 37,5:1	Bio-Rad	1610158	La acrilamida es dañina y tóxica.
Albúmina sérica bovina de grado de biología molecular	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	B9000S
Oligonucleótidos de ADN marcados con 5'IRDye700	Tecnologías de ADN integradas	Oligonucleótidos de ADN personalizados	En el manuscrito se denominan oligonucleótidos de ADN marcados con tinte 5' o marcados con colorante fluorescente infrarrojo. La compañía sintetizará a medida oligonucleótidos de ADN marcados con IRDye de 5'. Requiere un mínimo de 100 μM de síntesis a escala y purificación por HPLC.
Célula de electroforesis vertical Mini-PROTEAN	Bio-Rad	1658000FC	dispositivo
Sistema de imágenes infrarrojas Odyssey CLx	LI-COR Biotecnología	Sistema Imagng Infrarrojo Odyssey CLx	dispositivo
Sistema de imágenes Odyssey Fc	LI-COR Biotecnología	Sistema de imagen de modo dual Odyssey FC	dispositivo
Software Image Studio (versión 4.0)	LI-COR Biotecnología	Software Image Studio	software
Naranja G	Sigma-Aldrich	O3756-25G	químico
6x Tinte de carga naranja			0,25% g de naranja; 30% glicerol
0,5 veces TBE			45 mM de Tris-Borato; 1 mM de EDTA
1x TE			10 mM de Tris-HCl; 1 mM de EDTA, pH8.0
1x STE			100 mM de NaCl; 10 mM de Tris-HCl, pH8.0; 1 mM de EDTA
5x Búfer de enlace			50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA