Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Purificación de células de linaje de oligodendrocitos positivas para PDGFRα a partir de cerebro de ratón (modificado a partir de protocolos de inmunopanning descritos anteriormente)
- Preparación de una placa de inmunopaneo para la selección de células positivas para PDGFRα y 2 placas para la depleción de células endoteliales y microglía.
nota: Tenga en cuenta que las placas de Petri, pero no las placas de cultivo celular, funcionan para el experimento de inmunopanning; Si las células purificadas se van a utilizar para el cultivo, los pasos de inmunopanificación deben llevarse a cabo en la cabina de bioseguridad
- Cubrir una placa de Petri de 10 cm con 30 μL de IgG anti-ratas de cabra en 10 mL de pH 9,5, 50 mM de Tris-HCl durante la noche a 4 °C. Agite la placa para asegurarse de que las superficies de las placas estén cubierta de manera uniforme y completa por la solución de recubrimiento.
- Prepare la solución de anticuerpos PDGFRα diluyendo 40 μL de anticuerpo anti-PDGFRα de rata con 12 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco que contenga 0,2% de BSA.
- Después de 3 lavados de la placa recubierta de IgG con 10 mL 1x DPBS cada una, incube la placa recubierta de IgG con solución de anticuerpos PDGFRα a temperatura ambiente durante 4 h.
- Lave la placa recubierta de anticuerpos anti-PDGFRα para ratas 3 veces con 10 mL 1x DPBS cada una. Agregue suavemente la solución de DPBS a lo largo de la pared lateral de la placa y no moleste las superficies recubiertas.
- Cubrir 2 placas de Petri nuevas de 15 cm para la depleción de células endoteliales y microglía con 20 mL de DPBS que contengan 2,3 μg/mL de lectina 1 (BSL-1) de Banderiaea simplicifolia (BSL-1) durante 2 h.
- Lave las placas recubiertas BSL-1 3 veces con 20 mL 1x DPBS. Agregue suavemente la solución de DPBS a lo largo de la pared lateral de las placas y no moleste las superficies recubiertas.
- La purificación de células del linaje de oligodendrocitos PDGFRα positivos se modifica a partir de métodos publicados anteriormente.
- Diseccionar los tejidos corticales de 2 cerebros de ratón de día 7 (P7) postnatales de acuerdo con los protocolos publicados anteriormente.
- Disocie los tejidos para generar una suspensión unicelular con un kit de disociación de tejido neural (P) de acuerdo con las instrucciones detalladas del fabricante.
- Brevemente, corte los tejidos corticales disecados en pedazos con un bisturí y sométalos a digestión enzimática a 37 °C. Después de la digestión, disocie manualmente las piezas con pipetas Pasteur de vidrio pulido al fuego en una suspensión de una sola celda.
- Centrifugar la suspensión unicelular a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente y suspender el pellet de celda con 15 mL de tampón de inmunopanning (el tampón de immunopanning es DPBS con 0,02% de BSA y 5 μg/mL de insulina).
- Interincubar la suspensión unicelular de 2 cerebros de ratón secuencialmente en 2 placas recubiertas de BSL-1 durante 15 minutos a temperatura ambiente con una suave agitación de la placa cada 5 minutos para garantizar un mejor agotamiento de la microglía y las células endoteliales.
- Agite suavemente la placa para recoger las células no adherentes en la suspensión celular e incubarlas en la placa recubierta de anticuerpos contra ratas-PDGFRα durante 45 minutos a temperatura ambiente.
- Después de la incubación de la suspensión celular en la placa recubierta de anticuerpos PDGFRα para ratas, agite suavemente la placa para recoger la suspensión celular y enjuague la placa 8 veces con DPBS para deshacerse de las células no adherentes. Agregue suavemente la solución de lavado a lo largo de la pared lateral de la placa y agite la placa varias veces para eliminar las células no adherentes.
- Separe las células de la placa recubierta de anticuerpos contra PDGFRα rata utilizando un tratamiento de 4 ml de solución de desprendimiento de células durante 10 min a 37 °C. Agite la placa para desalojar las células adherentes.
- Recoja las OPC purificadas por centrifugación a 300 x g a temperatura ambiente, suspenda el pellet celular con 2 mL de medio de cultivo celular OPC y cuente las células usando azul de tripán y un hemocitómetro (500 mL de medio de cultivo celular en medio DMEM/F12 que contiene 5 mL de solución de penicilina-estreptomicina (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 μg/mL de insulina, 0,1% de BSA, 20 ng/mL de bFGF y 10 ng/mL de PDGFRα).
- Validación de la pureza de las OPCs después del inmunopanning.
- Para evaluar el enriquecimiento de las OPC después de la inmunopanificación, utilice algunas de las OPC purificadas para la extracción de ARN con una extracción a base de tiocianato de guanidio de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Realice qRT-PCR mediante el uso de una mezcla maestra de colorante verde fluorescente para verificar el enriquecimiento de la expresión de PDGFRα en OPC purificadas en comparación con las células cerebrales disociadas de acuerdo con los materiales publicados anteriormente.
- Además, siembre algunas OPC purificadas en las placas de 24 pocillos recubiertas de poli-D-lisina para la inmunotinción con el anticuerpo proteoglicano (NG2) de sulfato de condroitina (NG2) anti-NG2 como materiales publicados anteriormente.
>2. Preparación de ChIP de celda baja y construcción de bibliotecas de ChIP para secuenciación de alto rendimiento
- Olig2 Preparación de ChIP de baja célula con un sistema de sonicación disponible en el mercado y un kit de ChIP de bajo número de células disponible en el mercado (véase la tabla de materiales) siguiendo los procedimientos estándar detallados de las instrucciones del fabricante.
- Después de separar de la placa recubierta de anticuerpos anti-PDGFRα de rata y el recuento de células con azul de tripán y un hemocitómetro, coloque 20.000 OPC purificadas en un medio de cultivo celular OPC de 1 mL para cada reacción de ChIP.
- Añadir 27 μL de formaldehído al 36,5% para fijar la suspensión celular durante 10 min a temperatura ambiente.
cautela: Tenga en cuenta que se debe utilizar formaldehído en la campana de gases químicos por razones de seguridad.
- Detenga la reticulación de ADN y proteínas con 50 μL de glicina 2,5 M durante 5 min a temperatura ambiente.
nota: Todos los pasos deben realizarse sobre hielo o en una cámara frigorífica a 4 °C a partir de este punto.
- Lave los gránulos de celdas reticuladas con 1 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) helada con cóctel de inhibidores de proteasa y obtenga células granuladas por una centrífuga preenfriada a 300 x g a 4 °C.
- Limente el pellet celular en 25 μL de tampón de lisis completo durante 5 min en hielo.
nota: Agite el tubo para suspender las células en Lysis Buffer.
- Complemente el lisado celular con 75 μL de HBSS helado que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa y corte la cromatina del lisado celular mediante un sistema de sonicación preenfriado con 5 ciclos de 30 s ON y 30 s OFF. Sonicar siempre 6 tubos juntos y asegurarse de que los tubos de equilibrio contengan 100 μL de agua.
- Después del cizallamiento, centrifugar a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo después de la centrifugación.
- Diluir 100 μL de cromatina cortada con un volumen igual de tampón ChIP completo helado con el inhibidor de la proteasa.
- Guarde 20 μL de la cromatina cortada diluida como muestra de control de entrada.
nota: La muestra de control de entrada también es necesaria como comparación con la muestra inmunoprecipitada de Olig2 para identificar el ADN inmunoprecipitado del anticuerpo Olig2.
- Añadir 1 μL de anticuerpo anti-olig2 de conejo a 180 μL de cromatina cortada diluida e incubar el tubo de reacción en una rueda giratoria a 40 rpm durante 16 h a 4 °C.
nota: Realice este paso en una cámara frigorífica.
- Para cada reacción ChIP, lave 11 μL de perlas recubiertas de proteína magnética A con 55 μL de tampón de lavado de perlas y coloque el pellet de perlas en 11 μL de tampón de lavado de perlas después de 2 lavados.
nota: Realice este paso en una cámara frigorífica.
- Para cada reacción de ChIP, agregue 10 μL de perlas recubiertas de proteína A prelavadas al tubo de reacción de ChIP. Realice este paso en una cámara frigorífica.
- Incubar el tubo de reacción ChIP a 4 °C durante otras 2 h en una rueda giratoria.
- Coloque el tubo de reacción ChIP en la rejilla magnética durante 1 min.
nota: Realice este paso en una cámara frigorífica.
- Retire el sobrenadante y no desprenda la bolita de perla.
- Lave el pellet de perlas con 100 μL para cada uno de los 4 tampones de lavado, respectivamente, durante 4 minutos en una rueda giratoria a 4 °C.
- Después de los lavados, agregue 200 μL de tampón de elución al gránulo de perlas e incube el tubo de reacción ChIP a 65 °C durante 4 h para revertir la proteína-ADN de reticulación.
- Además, agregue 180 μL de tampón de elución a 20 μL de muestra de control de entrada e incube a 65 °C durante 4 h para revertir también la reticulación proteína-ADN.
- Agregue 200 μL 25:24:1 (v/v) de mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico a cada tubo de reacción ChIP.
- Vértice vigorosamente durante 1 min y centrifugue a 13.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Transfiera la fase superior a un nuevo tubo.
- Añadir 40 μL de solución de acetato de sodio 3M, 1.000 μL de etanol al 100% y 2 μL de precipitante de glucógeno unido covalentemente a un colorante azul a cada tubo de reacción ChIP durante la noche a -20 °C.
- Centrifugar a 13.000 x g durante 20 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante, lave con 500 μL de etanol frío al 70% y centrifugue a 13.000 x g durante 20 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante, mantenga el pellet seco al aire durante 10 minutos y disuelva el pellet con 50 μL de agua.
- Construcción de bibliotecas ChIP para secuenciación de alto rendimiento
- Limpie y concentre el ADN ChIP con un kit de limpieza de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Cuantifique la muestra de ChIP con un pico-green de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Utilice un kit ChIP-seq para el seguimiento en T, la replicación y el relaves, la conmutación y extensión de plantillas, la adición de adaptadores y amplificación, la selección del tamaño de la biblioteca y la purificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Después de la desnaturalización del dsDNA, desfosforila el extremo 3' del ssDNA por la fosfatasa alcalina de los camarones y agrega una cola de poli (T) al ssDNA por la desoxinucleotidil transferasa terminal.
- Recocido el cebador DNA Poly (dA) a la plantilla de ssDNA para la replicación del ADN y el cambio de plantilla.
- Después del cambio de plantilla, amplíe la biblioteca ChIP-seq por PCR con los cebadores directos e inversos para la indexación.
- Seleccione la biblioteca ChIP-seq amplificada por PCR con fragmentos que van de 250 a 500 pb por perlas paramagnéticas por la opción 2 para la selección de tamaño doble.
- Examine la calidad de la biblioteca ChIP-seq seleccionada utilizando un dispositivo de electroforesis capilar de chip microfluídico.
