1. Microscopía de polarización
- Para la iluminación láser de campo amplio, enfoque una línea de 638 nm de un láser de diodo continuo (40 mW) en la apertura de la fibra óptica multimodo para la limpieza del haz. Monte un polarizador lineal en la salida de la fibra para establecer la polarización de la luz láser.
- Bloquee el componente de excitación de la luz emitida con un espejo dicroico (corte de 640 nm) y un filtro de paso de banda (paso de banda 700/75).
- Deje que la señal de fluorescencia pase a través de un divisor de haz polarizador, que divide la luz emitida en sus componentes polarizados perpendiculares y paralelos. A continuación, enfoque el haz no reflejado (componente paralelo) y el haz reflejado (componente perpendicular) con una lente acromática de 200 mm de distancia focal en el chip de una cámara EM-CCD retroiluminada (Figura 1b y 1c). Utilice un espejo para ajustar la dirección del haz perpendicular hacia la lente.
>2. Diseño y prueba de oligómero de ADN de referencia marcado con fluorescencia
- Determinar la secuencia central del ADN de referencia: el método se basa en un ensayo competitivo que mide la constante de disociación (KD2) entre un factor de transcripción y un oligómero de ADN competidor no marcado que compite por unirse con un ADN marcado con fluorescencia cuya afinidad con el TF actúa como referencia (KD1). La secuencia de consenso obtenida de otras fuentes, como la huella de DNasa o el 1-híbrido bacteriano, puede servir como punto de partida.
nota: Como regla general, un ADN de referencia adecuado tiene una disminución de 3 a 7 veces en la afinidad de unión al TF en comparación con la secuencia de consenso.
- Mida por HiP-FA las KD1s de 2-3 mutaciones individuales tentativas de la secuencia de consenso derivada en el paso anterior. Intente mutar las posiciones en secuencias de consenso que no sean demasiado específicas para evitar la pérdida completa de enlace.
nota: Es importante que la secuencia de referencia esté ligada por el factor de transcripción de interés (que usamos en este protocolo Giant Gt), pero no demasiado fuerte, para que los competidores más débiles puedan superarla a altas concentraciones.
- Extienda el motivo central (generalmente de 8 a 12 pares de bases) a una longitud de 16 pares de bases o más agregando una secuencia de flanqueo simétrica en ambos lados (agregue cadenas laterales para una unión adecuada). Si es necesario (para dominios de unión más largos, por ejemplo), utilice secuencias más largas (se probaron hasta ~50 pares de bases de longitud con el ensayo HiP-FA).
cautela: Tenga cuidado de no agregar bases que se espera que creen sitios de enlace ectópicos. Utilice herramientas computacionales que predigan sitios de enlace a partir de PWM disponibles para facilitar este proceso (por ejemplo, PySite).
- Como ADN de referencia marcado, ordene oligómeros que estén marcados con fluorescencia en la hebra delantera o inversa en el extremo 3' o 5'. Utilice, por ejemplo, Cy5, Bodipy-650 o cualquier otro colorante adecuado a una concentración de 10 μM (100 μM 10x caldo) en agua, y diluya paso a paso como se describe en el paso 3.1.
- Prepare 500 mL de tampón de unión 1x agregando 33 mM de tampón de fosfato de potasio (pH = 7,0), 90 mM de NaCl y detergente no iónico al 0,01% en agua destilada. Prepare también el tampón de unión 3x, que contiene los mismos componentes, excepto en concentraciones triples. Si utiliza tampón de unión 3x como solución madre para el tampón de unión 1x, prepare volúmenes > 500 mL; de lo contrario, prepare 250 mL.
nota: Esta composición se optimizó para la estabilidad del factor de transcripción y para prevenir la dimerización de la glutatión S-transferasa (GST).
- Mida con la configuración de microscopía descrita en el paso 1 el FA de 200 μL de tampón de unión que contiene 0,8 nM de ADN de referencia marcado en presencia de diferentes cantidades de TF en una placa de microscopía con fondo de vidrio de 96 pocillos (5-6 pocillos con diferentes concentraciones de TF) para determinar la concentración de TF a utilizar. Realice una serie de valoración con cantidades crecientes de TF y elija para el ensayo la concentración para la cual la curva alcanza una meseta, lo que indica la unión completa del oligómero de referencia de ADN.
nota: La concentración óptima de TF depende de los valores de las constantes de disociación TF-ADN. Generalmente, los KDs más bajos requieren concentraciones más bajas.
>3. Recocido de oligómeros
- Para recocer los oligómeros de ADN del ADN de referencia marcado (secuencia determinada en el paso anterior), mezcle 7 μL de una solución de ADN monocatenario frontal marcada con colorante de 10 mM y 7 μL de una concentración de 10 mM de su complemento inverso no marcado en 186 μL de agua.
- Para las secuencias de ADN de la competencia, mezcle 20 μL de soluciones de 100 mM (en agua, proporcionadas por el fabricante) de ADN monocatenario directo con 20 μL de 100 mM del correspondiente ADN monocatenario inverso para cada secuencia individual de la competencia que se vaya a medir.
- Realice el recocido por separado en un ciclador de PCR estándar calentando las soluciones a 70 °C durante 3 min y disminuyendo la temperatura a RT a una velocidad de 0,1 K/s. Si la máquina de PCR utilizada no soporta gradientes de temperatura a esa velocidad, simplemente haga incubaciones escalonadas con temperaturas decrecientes (se probaron 99 ciclos de 3 s con -0,4 K por ciclo).
>4. Preparación del gel
NOTA: La siguiente sección explica la preparación de dos tipos diferentes de geles: 1) los pocillos de valoración contienen geles con proteínas y se utilizan para determinar los KDs para las respectivas secuencias de ADN competidoras, y 2) los pocillos de calibración hacen uso de NB para determinar la concentración de ADN en cada punto de tiempo dado y la altura de adquisición. La atención se centra en la preparación del experimento en una placa de 96 pocillos, pero también se indican los volúmenes correspondientes para un formato de placa de 384 pocillos.
- Disuelva la agarosa al 0,5% p/v de bajo punto de fusión en el tampón aglutinante hirviéndola en un horno de microondas de laboratorio. Después de la disolución completa, ajuste el volumen nuevamente con ddH2O para compensar la posible evaporación.
nota: Para mayor comodidad, prepare un caldo de 10-20 alícuotas de 10 ml de los geles y derrítalos a 75 ° C cuando sea necesario. Las existencias de gel se pueden almacenar en RT.
cautela: Tenga cuidado de evitar sobrecalentar la solución de gel en el horno microondas. Son preferibles intervalos de tiempo de calentamiento cortos con agitación en el medio.
- Para preparar los pocillos de valoración y calibración, primero se deben fundir dos alícuotas de caldo de gel de 10 mL a 75 °C bajo agitación.
- Utilice 240 μL (incluido el 20% de gastos generales) para cada competidor (n = número de secuencias de competidores).
- Utilice el mismo volumen de gel para la calibración del NB para garantizar la misma temperatura y viscosidad de ambos geles.
- A continuación, ajuste la temperatura a 35 °C y espere a que la temperatura se equilibre.
- Para los pocillos de valoración, añadir 1,4 nM (concentración final) de ADN de referencia hibridado (obtenido en el paso 3), proteína TF (concentración final CTF = 20-60 nM, según se determina en el paso 2.6), DTT (0,2 mM) y tampón de unión en un volumen total de n x 200 μL o n x 13 μL en un formato de placa de 96 o 384 pocillos. respectivamente (más gastos generales). Mezcle bien invirtiendo / agitando (no haga vórtice).
- Agregue lentamente 200 μL por pocillo en formato de placa de 96 pocillos (13 μL/pocillo para 386 pocillos) de la solución de gel preparada en el paso anterior en los pocillos de valoración de la placa de pocillos.
- Para los pocillos de calibración, primero, agregue 5 nM NB al gel derretido fuera de los pocillos (el volumen total depende del formato de placa de pocillo utilizado y del número de pocillos de calibración; generalmente 5-6 por placa de pocillo es suficiente).
- Pipetee 200 μL (13 μL para el formato de placa de 384 pocillos) de gel que contiene NB lentamente dentro de los pocillos de valoración de la placa de pocillos y asegúrese de evitar las burbujas de aire.
nota: El uso de pipetas electrónicas o robótica aumenta significativamente la reproducibilidad.
- Deje que el gel se solidifique durante 10 minutos a RT y otros 10 minutos a 4 °C (elimine la condensación del vidrio después si es necesario). Asegúrese de realizar todos estos pasos sobre una superficie perfectamente horizontal para evitar superficies de gel poco homogéneas.
nota: Los geles que contienen proteínas suelen ser estables durante al menos varias horas a 4 °C.
>5. Añadiendo la solución de ADN de la competencia
NOTA: Las siguientes soluciones deben prepararse antes de comenzar la valoración y se añaden simultáneamente a los pocillos de calibración y valoración.
- Agregue el ADN y la proteína de referencia marcados con recocido en un tampón de unión 3x a concentraciones 3 veces más altas que las alícuotas del stock de gel.
- Mezcle 20 μL de la solución obtenida con 40 μL de cada solución de ADN competidor recocida obtenida en el paso 3.
- Para cada pocillo de calibración, mezcle 20 μL de tampón de unión 3x que contenga 15 mM de solución NB con 40 μL de ADN competidor recocido (cualquier secuencia de la misma longitud es adecuada).
nota: Para las placas de 384 pocillos, use 21 μL en lugar de 60 μL en total.
- Opcionalmente, compruebe espectroscópicamente la homogeneidad de los niveles de altura del gel en los diferentes pocillos de la placa midiendo la absorbancia a 380 nm, utilizando un lector de placas multipocillo (los valores de absorbancia son proporcionales a las alturas del gel).
- Agregue 50 μL (7 μL para el formato de placa de 384 pocillos) de las soluciones de ADN mixtas de la competencia (recocidas en el paso 3) encima de los geles. Intente agregar todas las soluciones de la competencia lo más simultáneamente posible mediante el uso de pipetas electrónicas multicanal o un cabezal de pipeteo de 96 canales, si está disponible. Después de la adición de las soluciones de la competencia, coloque la placa en la platina del microscopio y comience las mediciones inmediatamente.
>6. Adquisición de imágenes
- Adquiera secuencialmente series de tiempo de pilas z (por ejemplo, use 12 planos y 100-300 ms de tiempo de iluminación). Evite tomar imágenes demasiado cerca de la superficie del pozo (< ~ 1,4 μm con las placas utilizadas en este documento) para excluir cualquier sesgo de polarización.
- Realice de 10 a 25 ciclos de mediciones hasta que se desvincule completamente el ADN de referencia marcado del TF. El punto final generalmente se alcanza después de 1-2 h, dependiendo de la cinética de unión y la difusividad del ADN de la competencia.
