1. Preparación del sistema
- Diseño de plásmidos de sitios de unión
- Diseñe el casete del sitio de encuadernación como se muestra en la Figura 1. Cada minigen contiene las siguientes partes (5' a 3'): sitio de restricción Eagl, ∼40 bases del extremo 5' del gen de resistencia a la kanamicina (Kan), promotor pLac-Ara, sitio de unión al ribosoma (RBS), AUG del gen mCherry, un espaciador (δ), un sitio de unión RBP, 80 bases del extremo 5' del gen mCherry, y un sitio de restricción ApaLI.
nota: Para aumentar la tasa de éxito del ensayo, diseñe tres casetes de sitio de unión para cada sitio de unión, con espaciadores que consten de al menos una, dos y tres bases. Consulte la sección Resultados representativos para obtener más instrucciones.
- Clonación de plásmidos de sitios de unión
- Ordene los casetes de sitios de unión como minigenes de ADN bicatenario (dsDNA). Cada minigen tiene una longitud de ∼500 pb y contiene un sitio de restricción Eagl y un sitio de restricción ApaLI en los extremos 5' y 3', respectivamente (véase el paso 1.1.1).
nota: En este experimento, se ordenaron minigenes con la mitad del gen de la kanamicina para facilitar la detección de colonias positivas. Sin embargo, el ensamblaje de Gibson también es adecuado aquí, en cuyo caso el sitio de unión se puede ordenar como dos oligonucleótidos de ADN monocatenario complementarios más cortos.
- Digestión doble de los minigenes y el vector objetivo con Eagl-HF y ApaLI mediante el protocolo de restricción y purificación en columna.
- Ligue los minigenes digeridos a la columna vertebral del sitio de unión que contiene el resto del gen reportero mCherry, el terminador y un gen de resistencia a la kanamicina.
- Transformar la solución de ligadura en células TOP10 de Escherichia coli.
- Identifique los transformadores positivos a través de la secuenciación de Sanger.
- Diseñe un cebador con 100 bases aguas arriba de la región de interés (consulte la Tabla 1 para ver las secuencias de cebadores).
- Miniprepara algunas colonias bacterianas.
- Prepare 5 μL de una solución de 5 mM del cebador y 10 μL del ADN a una concentración de 80 ng/μL.
- Envíe las dos soluciones a un centro conveniente para la secuenciación de Sanger.
- Almacene plásmidos purificados a -20 °C y cepas bacterianas como reservas de glicerol, ambos en el formato de 96 pocillos. A continuación, el ADN se utilizará para su transformación en células TOP10 de E. coli que contengan uno de los cuatro plásmidos RBP de fusión (véase el paso 1.3.5).
- Diseño y construcción del plásmido RBP
NOTA: Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las proteínas de la cubierta utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 2.
- Ordene la secuencia RBP requerida que carece de un codón de parada como un minigen de dsDNA ordenado a medida que carece de un codón de parada con sitios de restricción en los extremos (Figura 1).
- Clonar la RBP probada que carece de un codón de parada inmediatamente aguas abajo de un promotor inducible y aguas arriba de una proteína fluorescente que carece de un codón de inicio (Figura 1), de forma similar a los pasos 1.2.2-1.2.4. Asegúrese de que el plásmido RBP contenga un gen de resistencia a los antibióticos diferente al del plásmido del sitio de unión.
- Identifique los transformadores positivos a través de la secuenciación de Sanger, similar al paso 1.2.5 (consulte la Tabla 1 para las secuencias de cebadores).
- Elija un transformador positivo y hágalo químicamente competente. Almacene plásmidos purificados con glicerol a -20 °C y las existencias de glicerol de las cepas bacterianas a -80 °C en placas de 96 pocillos.
- Transforme los plásmidos del sitio de unión (del paso 1.2.6) almacenados en placas de 96 pocillos en células bacterianas químicamente competentes que ya contienen un plásmido RBP-mCerulean. Para ahorrar tiempo, en lugar de colocar las células en placas de Petri, póngalas con una pipeta de 8 canales en placas de 8 carriles que contengan agar Luria-Bertani (LB) con los antibióticos correspondientes (Kan y Amp). Las colonias deberían aparecer en 16 h.
- Seleccione una sola colonia para cada transformante doble y crezca durante la noche en medio LB con los antibióticos correspondientes (Kan y Amp) y almacene como reservas de glicerol a -80 °C en placas de 96 pocillos.
>2. Configuración del experimento
NOTA: El protocolo presentado aquí se realizó utilizando un sistema robótico de manejo de líquidos en combinación con una incubadora y un lector de placas. Cada medición se llevó a cabo para 24 concentraciones de inductores, con dos duplicados para cada combinación de cepa + inductor. Utilizando este sistema robótico, se recogieron datos de 16 cepas al día con 24 concentraciones de inductores. Sin embargo, si no se dispone de un dispositivo de este tipo, o si se necesitan menos experimentos, estos se pueden hacer fácilmente a mano utilizando una pipeta múltiple de 8 canales y adaptando el protocolo en consecuencia. Por ejemplo, se obtuvieron resultados preliminares para cuatro cepas por día con 12 concentraciones de inductores y cuatro puntos de tiempo de esta manera.
- Preparar, de antemano, 1 L de tampón de bioensayo (BA) mezclando 0,5 g de triptona, 0,3 mL de glicerol, 5,8 g de NaCl, 50 mL de 1 M de MgSO4, 1 mL de tampón 10x solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 y 950 mL de agua bidestilada (DDW). Filtro en autoclave o estéril del tampón BA.
- Cultivar las cepas de doble transformante a 37 °C y 250 rpm agitándolas en 1,5 mL LB con antibióticos apropiados (kanamicina a una concentración final de 25 μg/mL y ampicilina a una concentración final de 100 μg/mL), en placas de 48 pocillos, durante un período de 18 h (durante la noche).
- Por la mañana, haga los siguientes preparativos.
- Placa inductora. En una placa limpia de 96 pocillos, prepare los pocillos con medio semipobre (SPM) que consta de 95% de BA y 5% de LB26 en la incubadora a 37 °C. El número de pocillos corresponde al número deseado de concentraciones de inductores. Añada C4-HSL a los pocillos de la placa inductora que contendrán la concentración más alta de inductor (218 nM).
- Programe el robot para diluir en serie el medio de cada uno de los pozos de mayor concentración en 23 concentraciones más bajas que van de 0 a 218 nM. El volumen de cada dilución inductora debe ser suficiente para todas las cepas (incluidas las duplicadas).
- Mientras se preparan las diluciones del inductor, caliente 180 μL de SPM en la incubadora a 37 °C, en placas de 96 pocillos.
- Diluir las cepas nocturnas del paso 2.2 por un factor de 100 mediante diluciones en serie: primero, diluir por un factor de 10 mezclando 100 μL de bacterias con 900 μL de SPM en placas de 48 pocillos, y luego diluir nuevamente por un factor de 10 tomando 20 μL de la solución diluida en 180 μL de SPM precalentado, en placas de 96 pocillos aptas para mediciones fluorescentes.
- Agregue el inductor diluido de la placa inductora a las placas de 96 pocillos con las cepas diluidas de acuerdo con las concentraciones finales.
- Agite las placas de 96 pocillos a 37 °C durante 6 h, mientras realiza mediciones de densidad óptica a 595 nm (OD595), mCherry (560 nm/612 nm) y mCerulean (460 nm/510 nm) de fluorescencia a través de un lector de placas cada 30 min. Para fines de normalización, mida el crecimiento de SMP sin agregar celdas.
