1. Día 9 (mañana): Iniciar el cultivo para la medición enzimática.
- Vuelva a suspender el cultivo y transfiéralo 125 μL utilizando una pipeta multicanal en una placa de espectrofotómetro (medida OD600).
nota: Precaución: No dispense la última gota para evitar burbujas, si el OD600 es inferior a 0,3 - 0,6, incube las células restantes durante 1 - 2 h más según la lectura. El cultivo de 125 μL utilizado en este paso se puede descartar o transferir de nuevo al bloque de pocillo profundo original a discreción del usuario.
- Centrifugar las células restantes en el bloque de pocillos profundos durante 10 min a 3000 x g y 21 °C. Eliminar el sobrenadante invirtiendo.
- Añadir 200 μL de tampón Z y vortex.
nota: Consulte la receta para el tampón Z en la Tabla 1.
- Centrifugar durante 5 min a 3000 x g y 21 °C. Eliminar el sobrenadante invirtiéndolo.
- Agregue 20 μL de tampón Z y vórtice.
- Cubra la placa con papel de sellado que pueda resistir los ciclos de congelación y descongelación. Realizar 4 ciclos de congelación/descongelación con nitrógeno líquido en campana extractora y a 42 ºC en baño maría (2 min cada uno).
- Añadir 200 μL de tampón Z/beta-mercaptoetanol (β-ME)/orto-nitrofenil-β-galactósido (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8,4 mg respectivamente producirán 20 mL de solución; siempre preparar fresco)
nota: El ONPG tardará algún tiempo en disolverse correctamente, así que prepare la solución una hora antes de llegar a este paso. El ONPG sirve como sustrato para la medición de la actividad de la β-galactosidasa.
- Incubar durante un máximo de 17 a 24 h a 30 °C (compruebe entre medias, si el color se desarrolla antes, proceda al siguiente paso).
>2. Día 10 (mañana): Detén la reacción y mide.
- Agregue 110 μL 1M Na2CO3 para detener la reacción y registrar el tiempo.
- Vórtice y centrífuga durante 10 min a 3000 x g y 21 °C.
- Tome 125 μL de sobrenadante utilizando multicanal y mida OD420.
nota: Atención, no dispense la última gota para evitar burbujas.
Tabla 1: Receta de las soluciones utilizadas en el protocolo. La tabla proporciona la receta para las soluciones madre y de trabajo de los principales tampones utilizados en el ensayo.
| Tampón TE 10X (10 ml) | |
| deseable | De la culata |
| 1000mM Tris-Cl (pH 8.0) | 1mL de Tris 1M |
| 10mM EDTA (pH 8.0) | 200uL de EDTA 0.5M |
| Compensar el volumen con agua | |
| TE/LiAc (10 ml) | |
| deseable | De la culata |
| 1X | 1mL TE 10X |
| 0,1 millones de LiAc | 1mL LiAc 1M |
| Compensar el volumen con agua | |
| TE/LiAc/PEG (50 mL) 50% | |
| deseable | De la culata |
| 1X | 5 mL TE 10X |
| 0,1 millones de LiAc | 5 mL LiAc 1M |
| 40 mL PEG3350 | |
| Tampón Z (1L) pH 7.0 | |
| Na2HPO4 16,1g de heptahidratado o 8,52g de anhidro |
| NaH2PO4 5,5 g de hidratado o 4 g de anhidro |
| KCl 0.75g |
| MgSO4 0,246g de hidratado o 0,12g de anhidro |
| Mantener el pH con HCl |
| Todas las soluciones se esterilizan antes de su uso. |
| Media y placas de agar utilizadas en el protocolo (YPDA, SD-Ura; Las placas de agar SD-Trp-Ura y SD-Trp-Ura) siguen la misma receta que en Y1H |
