Ensayo híbrido de levadura y uno modificado para detectar interacciones heteroméricas entre el complejo de proteínas y el ADN

1. Día 9 (mañana): Iniciar el cultivo para la medición enzimática.

1. Vuelva a suspender el cultivo y transfiéralo 125 μL utilizando una pipeta multicanal en una placa de espectrofotómetro (medida OD₆₀₀).
   nota: Precaución: No dispense la última gota para evitar burbujas, si el OD₆₀₀ es inferior a 0,3 - 0,6, incube las células restantes durante 1 - 2 h más según la lectura. El cultivo de 125 μL utilizado en este paso se puede descartar o transferir de nuevo al bloque de pocillo profundo original a discreción del usuario.
2. Centrifugar las células restantes en el bloque de pocillos profundos durante 10 min a 3000 x g y 21 °C. Eliminar el sobrenadante invirtiendo.
3. Añadir 200 μL de tampón Z y vortex.
   nota: Consulte la receta para el tampón Z en la Tabla 1.
4. Centrifugar durante 5 min a 3000 x g y 21 °C. Eliminar el sobrenadante invirtiéndolo.
5. Agregue 20 μL de tampón Z y vórtice.
6. Cubra la placa con papel de sellado que pueda resistir los ciclos de congelación y descongelación. Realizar 4 ciclos de congelación/descongelación con nitrógeno líquido en campana extractora y a 42 ºC en baño maría (2 min cada uno).
7. Añadir 200 μL de tampón Z/beta-mercaptoetanol (β-ME)/orto-nitrofenil-β-galactósido (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8,4 mg respectivamente producirán 20 mL de solución; siempre preparar fresco)
   nota: El ONPG tardará algún tiempo en disolverse correctamente, así que prepare la solución una hora antes de llegar a este paso. El ONPG sirve como sustrato para la medición de la actividad de la β-galactosidasa.
8. Incubar durante un máximo de 17 a 24 h a 30 °C (compruebe entre medias, si el color se desarrolla antes, proceda al siguiente paso).

>2. Día 10 (mañana): Detén la reacción y mide.

1. Agregue 110 μL 1M Na₂CO₃ para detener la reacción y registrar el tiempo.
2. Vórtice y centrífuga durante 10 min a 3000 x g y 21 °C.
3. Tome 125 μL de sobrenadante utilizando multicanal y mida OD₄₂₀.
   nota: Atención, no dispense la última gota para evitar burbujas.

Tabla 1: Receta de las soluciones utilizadas en el protocolo. La tabla proporciona la receta para las soluciones madre y de trabajo de los principales tampones utilizados en el ensayo.