Medición de la actividad helicasa de una proteína diana utilizando dúplex de ARN marcados con biotina

Resumen

Fuente: Yu, L. et al., Ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones proteína-ácido nucleico. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, demostramos el procedimiento para determinar la actividad helicasa de una proteína objetivo para desenrollar el sustrato de dsRNA marcado con biotina. La actividad de la enzima se identificó mediante el análisis del cambio de movilidad electroforética, seguido de un ensayo de quimioluminiscencia utilizando estreptavidina conjugada con enzima quimioluminiscente.

Protocolo

1. Preparación de proteínas

1. Construcciones de expresión MOV10
   1. Genere construcciones de expresión de ADNc que codifican el ratón MOV10.
      1. Configure las reacciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cada fragmento. Mezcle 1 μL de ADNc de ratón (de testículo de ratón C57BL/6), 1 μL de dNTP, 2 μL de cebador directo de 10 μM, 2 μL de cebador inverso de 10 μM, 1 μL de ADN polimerasa, 25 μL de tampón PCR 2x y 18 μL de H₂O (ddH₂O) de doble destilación en un volumen final de 50 μL.
         nota: Los cebadores para la amplificación de fragmentos del gen Mov10 se enumeran en la Tabla 1.
      2. Realice reacciones de PCR utilizando los siguientes programas: 95 °C durante 5 min, 35 ciclos de calentamiento a 95 °C durante 15 s, recocido a 64 °C durante 15 s, extensión a 72 °C durante 20 s (2 min para extensión completa de MOV10) y extensión final a 68 °C durante 7 min.
   2. Analice el ADN de PCR amplificado mediante electroforesis en gel, corte la banda del tamaño requerido del gel rápidamente bajo una lámpara UV y colóquela en un tubo de centrífuga.
      nota: El tamaño esperado del producto visible en el gel de agarosa para MOV10 es de 3015 pb.
   3. Purifica el ADN de la PCR con un kit de extracción en gel siguiendo el protocolo del fabricante.
      1. Agregue un volumen igual de tampón de disolución en el tubo de centrífuga del paso 1.1.2 y derrita el gel en un baño de agua a 50-55 °C durante 5-10 minutos, asegurándose de que las piezas de gel se derritan por completo. Centrifugar brevemente para recoger las gotas de la pared del tubo.
         nota: La concentración de masa/volumen del gel y del tampón de disolución es de 1 mg/μL.
      2. Coloque la columna de adsorción en el tubo de recolección, transfiera la solución que contiene el fragmento de gel disuelto a la columna de adsorción y centrifugue a 12.000 x g durante 2 min.
      3. Deseche el filtrado en el fondo de los tubos de recolección. Añadir 600 μL del tampón de lavado a la columna, centrifugar a 12.000 x g durante 1 min y desechar el filtrado.
      4. Repita el paso 1.1.3.3 una vez.
      5. Vuelva a colocar la columna en el tubo de recolección y centrifuga a 12.000 x g durante 2 minutos para eliminar todo el tampón de lavado restante.
      6. Coloque la columna de adsorción en un tubo de centrífuga esterilizado de 1,5 mL, agregue 50 μL de ddH₂O al centro de la columna de adsorción y centrifugue a 12,000 x g durante 1 min. Mida la concentración de ADN del eluido usando un espectrofotómetro.
   4. Restricción de la digestión de plásmidos
      1. Digiera el vector pRK5 con BamHI y XhoI mezclando 4 μg de vector pRK5, 5 μL de tampón de digestión 10x, 1 μL de BamHI y 1 μL de XhoI y ddH₂O hasta un volumen de reacción final de 50 μL. Incubar a 37 °C durante 2 h.
   5. Analice el ADN vectorial mediante electroforesis en gel, corte rápidamente la banda del tamaño deseado del gel con un bisturí bajo una lámpara UV y colóquela en un tubo de centrífuga.
   6. Purifique el ADN vectorial con un kit de extracción en gel como 1.1.3 siguiendo las instrucciones del fabricante.
   7. Configure una reacción de ligadura recombinante estándar combinando 0,03 pmol de vector linealizado, 0,06 pmol de fragmento de ADNc, 2 μL de ligasa y 4 μL de tampón de ligasa 5x y ddH₂O en un volumen de reacción final de 10 μL.
      nota: Clona MOV10 en un vector pRK5.
   8. Incubar la mezcla a 37 °C durante 30 minutos y enfriar la reacción inmediatamente durante 5 minutos en hielo. Transforme los plásmidos recombinantes MOV10 en bacterias DH5α.
      nota: Verifique todas las construcciones recombinantes mediante secuenciación de Sanger.
   9. Preparar las existencias de glicerol de los cultivos bacterianos que contengan plásmidos recombinantes verificados añadiendo un volumen igual de 50% de glicerol a los cultivos líquidos y almacenándolos a -80 °C.
      nota: Para cada experimento subsiguiente, extraiga las bacterias de las reservas de glicerol en una placa de agar fresca y use una sola colonia para la expansión como se describe en el paso 1.2.
2. Extractos de proteínas MOV10 de células HEK293T
   1. Expresan transitoriamente las proteínas MOV10 en células HEK293T cultivadas.
      1. Prepare el plásmido MOV10-pRK5 a una concentración >500 ng/μL.
      2. Siembre las células HEK293T en platos de 15 cm. Cuando la densidad celular alcance ~70%-90%, reemplace el medio de cultivo celular con el medio Eagle Modificado (DMEM) fresco de Dulbecco que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina.
      3. Para una transfección, diluya 60 μg de ADN plasmídico MOV10-pRK5 en 3 mL del medio sérico reducido, luego agregue 120 μL del reactivo potenciador de la transfección y mezcle bien.
      4. En un tubo aparte, diluir 90 μl del reactivo de transfección con 3 mL de medio sérico reducido (sin penicilina-estreptomicina) y mezclar bien.
      5. Agregue el ADN diluido a cada tubo de reactivo de transfección diluido. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
      6. Agregue la mezcla de transfección al cultivo celular y cultive las células durante ~ 36-48 h.
   2. Después de 36-48 h, recoja las células de cada placa en un tubo de 50 ml. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Laver cada pellet con 10 mL de PBS helado y recoger las células por centrifugación a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
   3. Vuelva a suspender el pellet en 3 mL de tampón de lisis celular que contiene un cóctel completo de inhibidores de la proteasa libre de etilendiaminotetraacético (EDTA). Incubar durante 30 min en hielo. Centrifugar el lisado a 20.000 x g y 4 °C durante 20 min.
   4. Añadir 100 μL de perlas magnéticas anti-FLAG por placa de células en un tubo de 1,5 mL.
   5. Lave las perlas magnéticas 2 veces con tampón K150 (50 mM HEPES a pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
      1. Vuelva a suspender las perlas magnéticas en 1 ml de tampón K150 helado.
      2. Incubar las perlas magnéticas durante 2 min a 4 °C con una rotación suave y pelar las perlas magnéticas con la ayuda de un imán. Retire y deseche el sobrenadante.
   6. Añadir las perlas magnéticas al sobrenadante de lisado celular del paso 1.3.3 e incubar a 4 °C durante 2 h.
   7. Lave las perlas magnéticas unidas a proteínas 3 veces con tampón K150, luego 2 veces con K150 que contiene 250 mM de NaCl, luego 3 veces con tampón K150 como 1.3.5.
   8. Vuelva a suspender las perlas en 300 μL de tampón de elución FLAG (100 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl a pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 10% de glicerol), añada el péptido FLAG a una concentración final de 0,5 μg/μL e incube con perlas en un rotador a 4 °C durante 1 h, luego granule las perlas magnéticas con la ayuda de un imán.
   9. Recoja el sobrenadante que contiene las proteínas MOV10 eluidas, determine la concentración y almacene a -80 °C para su uso futuro.

2. Preparación de ácidos nucleicos

1. Compre oligonucleótidos de ADN y ARN (oligos) con o sin etiquetas de biotina de una fuente adecuada. Diluya cada oligonucleótido en ddH₂O libre de RNasa a 20 μM y manténgalo a -80 °C para su uso futuro.
   nota: Las secuencias de oligonucleótidos de sustratos de ADN/ARN utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 2.
2. Prepare la siguiente mezcla para la reacción de recocido de ARN bicatenario (dsRNA) para el ensayo de actividad helicasa MOV10: mezcle 60 mM de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-etano-sulfónico (HEPES) a pH 7,5, 6 mM de KCl, 0,2 mM de MgCl₂ y ddH₂O libre de ARNasa en un volumen de reacción final de 20 μL.
Los
3. oligonucleótidos de ARN recocido forman un dúplex de ARN calentando una mezcla de la hebra superior marcada con biotina (2 μM, concentración final) y 1,5 veces su hebra inferior complementaria no marcada en el tampón de recocido (paso 2.2) a 95 °C durante 5 min, y luego enfriándola lentamente a temperatura ambiente (RT).

3. Ensayos bioquímicos in vitro

1. EMSA y reacciones enzimáticas
   1. Para el ensayo de actividad helicasa MOV10, mezcle 50 mM de Tris-HCl a pH 7,5, 20 mM de KoAc, 2 mM de MgCl₂, 0,01% de NP-40, 1 mM de DTT, 2 U/μL de inhibidor de ARNasa, 10 nM de sustrato de ARN marcado con biotina, 2 mM de trifosfato de adenosina (ATP), 100 nM de trampa de ARN y 20 ng de proteína MOV10 y_ddH2O en un volumen de reacción final de 20 μL. Incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 10 min. 30 min, y 60 min. Agregue el tampón de parada 5x para detener la reacción.
      nota: Trampa de ARN, un oligonucleótido no marcado con biotina con secuencia, complementariedad con el oligonucleótido marcado, lo que evita que el dsRNA desenrollado vuelva a recocido.
2. Geles de poliacrilamida
   1. Lavar las placas de gel (16 cm x 16 cm) y los peines de 1,5 mm. Ensamble las unidades de electroforesis en gel.
   2. Para preparar un gel de poliacrilamida nativa al 10%, mezcle 14 mL de ddH₂O, 1,25 mL de ácido tris-bórico-EDTA (TBE) 10x, 8,3 mL de acrilamida al 30%, 1,25 mL de glicerol al 50%, 187,5 μL de persulfato de amonio (APS) al 10% recién preparado y 12,5 μL de tetrametiletilendiamina (TEMED).
   3. Para preparar un gel de poliacrilamida nativa al 20%, mezcle 5,5 mL de_ddH2O, 1,25 mL de 10x TBE, 1,25 mL de glicerol al 50%, 16,7 mL de acrilamida al 30%, 187,5 μL de APS al 10% y 12,5 μL de TEMED.
   4. Vierta la solución de acrilamida inmediatamente en el gel e inserte el peine. Deje que la mezcla polimerice durante aproximadamente 30 min.
3. Gel running
   1. Retire el peine y llene los tanques con el tampón de ejecución de electroforesis (0,5x TBE).
   2. Enjuague los pocillos de muestra con tampón 0,5x TBE, luego pre-ejecute el gel a 100 V en hielo durante 30 min. Reemplace el tampón de funcionamiento con 0,5x TBE nuevo.
   3. Cargue muestras de 20-25 μL en cada pocillo.
   4. Utilice un gel de acrilamida nativa al 10% para el ensayo EMSA y un gel de acrilamida nativa al 20% para los ensayos enzimáticos. Ejecute la electroforesis a 100 V en el baño de hielo hasta que el marcador azul de bromofenol haya migrado al cuarto inferior del gel.
4. Desmonte las placas de gel y recorte el gel quitando los pozos de carga y los carriles no utilizados. Coloque el gel en un tampón TBE de 0,5x.
5. Corta el papel de filtro y la membrana de nailon al tamaño del gel. Humedece previamente el papel de filtro limpio y la membrana de nylon.
6. Ensamble la pila para la transferencia.
   1. Coloque la membrana prehumedecida sobre el papel de filtro prehumedecido.
   2. Coloca el gel sobre la membrana.
   3. Cubre el gel con otra capa de papel de filtro prehumedecido.
   4. Elimine todas las burbujas de aire enrollando una pipeta limpia desde el centro hasta el borde.
7. Transfiera las muestras del gel a la membrana en un aparato electroforético semiseco a 90 mA durante 20 min.
8. Detenga la transferencia y luego seque la membrana en un papel de filtro nuevo durante 1 min.
9. Reticulación de las muestras irradiando la membrana a 120 mJ/^cm2 durante 45-60 s en un reticulante de luz UV equipado con bombillas de 254 nm (función de reticulación automática). Secar al aire la membrana a temperatura media durante 30 min.
10. Detección de quimioluminiscencia
    1. Protocolo 1: Utilice un volumen estándar de kit comercial de detección de ácido nucleico quimioluminiscente.
       1. Añadir 20 mL de tampón de bloqueo a la membrana e incubar durante 15-30 min agitando suavemente un rotador a 20-25 rpm.
       2. Prepare la solución tampón conjugada/bloqueante añadiendo 66,7 μL de conjugado de estreptavidina-rábano picante peroxidasa estabilizado a 20 mL de tampón bloqueante.
       3. Retire suavemente el tampón de bloqueo y reemplácelo con tampón conjugado/de bloqueo. Incubar durante 15 min en un rotador a 20-25 rpm.
       4. Lave la membrana 4 veces agitando a 40-45 rpm durante 5 minutos cada una.
       5. Agregue 30 mL de tampón de equilibrio de sustrato a la membrana. Incubar la membrana durante 5 min agitando a 20-25 rpm.
       6. Prepare la solución de trabajo del sustrato agregando 6 mL de solución de luminol/potenciador a 6 mL de solución de peróxido estable. Evite la luz.
       7. Cubra toda la superficie de la membrana con una solución de trabajo de sustrato e incube durante 5 min.
       8. Escanee la membrana en un sistema de imágenes quimioluminiscentes durante 1-3 s.

Tabla 1: Primers utilizados para la PCR amplificar los fragmentos génicos de Meiob y Mov10.Las letras en negrita en las imprimaciones hacia adelante y hacia atrás son sitios de corte BamHI y NotI; las letras cursivas en negrita en una imprimación inversa son sitios de corte XhoI; las letras en negrita en los recuadros indican los nucleótidos correspondientes a la mutación puntual R235A.

Fragmentos	Imprimaciones	Secuencias (de 5' a 3')
MEIOB-A	adelante	CGGGATCCATGTTACTTTTTGTGTGTGTGTGTGATACACTTGCC
	Marcha atrás	ENGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-C	adelante	CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA
	Marcha atrás	CGATGCGGCCGCCTCTTTATTTTCTCTTATATAATTCAGTAG
MEIOB-E	adelante	CCGCGTGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	Marcha atrás	CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-E-mut	adelante	CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC
	Marcha atrás	GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG
MOV10	adelante	GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC
	Marcha atrás	GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG

Tabla 2: Secuencias de sustratos de ADN/ARN utilizadas en este trabajo.

En el caso de las cifras	Nombres	Secuencias (de 5' a 3')
Figura 2, 5	36 nt ssDNA	5'-Biotina-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
Figura 3	36 nt ssRNA	5'-Biotina-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU-3' (ARN)
Figura 4	54 nt 5' dsRNA de cola	5'-Biotina-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (ARN) 5'-ACGAGGGAGACGAGGAGAGAGAGAGCGACGGCAGCGGU-3'(ARN)

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
equipo
centrífuga	Eppendorf, Alemania	5242R
Sistema de imágenes quimioluminiscentes	Tanon, China	5200
Sonífero digital	Branson, Estados Unidos	BBV12081048A	450 vatios; 50/60 HZ
Secante electroforético semiseco	Hoefer, Estados Unidos	TE77XP
Revólver de tubo	Crystal, Estados Unidos	3406051
Reticulante de luz ultravioleta	UVP, Estados Unidos	CL-1000
materiales
Membrana de nailon	Thermo Scientific, EE. UU.	TG263940A
Plato de cultivo tratado con TC	Corning, Estados Unidos	430167	100 milímetros
Plato de cultivo tratado con TC	Corning, Estados Unidos	430597	150 milímetros
Microtubos tubos	AXYGEN, ESTADOS UNIDOS	MCT-150-C	1,5 ml
Tubos	Corning, Estados Unidos	430791	15 mL
Reactivos
Cuentas magnéticas Anti-FLAG M2	Sigma, Estados Unidos	M8823
ATP	Thermo Scientific, EE. UU.	591136
Kit de desarrollo de color de fosfatasa alcalina BCIP/NBT	Beyotime, China	C3206
Reactivo de lisis celular CelLyticTM M	Sigma, Estados Unidos	107M4071V
Kit de clonación de un solo paso ClonExpress II	Vazyme, China	C112
Kit de detección de ácido nucleico quimioluminiscente	Thermo Scientific, EE. UU.	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, Estados Unidos	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, Estados Unidos	10569044
EDTA	Invitrogen, Estados Unidos	AM9260G	0,5 m
Cóctel de inhibidores de proteasas sin EDTA	Roche, Estados Unidos	4693132001
Kit de plásmido EndoFree Maxi	Vazyme, China	DC202
Mini kit de extracción de ADN en gel FastPure	Vazyme, China	DC301-01
FBS	Gibco, Estados Unidos	10437028
Péptido FLAG	Sigma, Estados Unidos	F4799
glicerol	Sigma, Estados Unidos	SHBK3676
Búfer HEPES	Sigma, Estados Unidos	SLBZ2837	1 M
KOAc	Sangon Biotech, China	127-08-02
MgCl2	Invitrogen, Estados Unidos	AM9530G	1 M
NaCl	Invitrogen, Estados Unidos	AM9759	5M
NP-40	Amresco, Estados Unidos	M158-500ML
Medio Opti-MEM	Gibco, Estados Unidos	31985062
Pbs	Gibco, Estados Unidos	10010023	pH 7.4
Inhibidor de la ARNasa	Promega, Estados Unidos	N251B
Estreptavidina fosfatasa alcalina	Promega, Estados Unidos	V5591
TBE	Invitrogen, Estados Unidos	15581044
Búfer Tris-HCI	Invitrogen, Estados Unidos	15567027	1 M, pH 7,4
Búfer Tris-HCI	Invitrogen, Estados Unidos	15568025	1 M, pH 8.0
Preadolescente-20	Sangon Biotech, China	A600560