Visualización basada en inmunofluorescencia de las interacciones de las proteínas de reparación del ADN

1. Extracción nuclear y fijación celular

1. Preparar soluciones madre: 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M sacarosa, 1 M MgCl₂, 0,1 M EGTA (pH 8,0).
2. Prepare el tampón de extracción nuclear (NEB): disuelva 10 mM de tuberías (pH 6,8), 100 mM de NaCl, 300 mM de sacarosa, 3 mM de MgCl₂, 1 mM de EGTA (pH 8,0) y 0,5% (v/v) de Triton X-100 en ddH₂O. Mezclar hasta que se disuelva por completo.
3. Preparar paraformaldehído (PFA) al 4% (v/v): disolver 10 mL de solución acuosa de PFA al 16% en 30 mL de PBS. Mezclar hasta que se disuelva por completo.
4. En el momento adecuado (t=0, 1, 2, 4, 16 h), lavar las células dos veces con 1 mL de PBS. Elimine PBS por completo.
5. Agregue 200 μL de NEB a cada pocillo para la extracción del núcleo celular (el citoplasma se degrada, solo queda el núcleo) (Figura 1). Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente y retirar completamente.
   nota: No exceda los 2 minutos.
6. Lave las células con 1 mL de PBS. Elimine PBS por completo. Agregue PBS con cuidado, las células son muy frágiles en este paso.
7. Agregue 200 μL de PFA al 4% (v/v) a cada pocillo para la fijación celular. Incubar durante 10 minutos a 4 °C. Eliminar completamente el PFA.
8. Agregue 1 mL de PBS.
   nota: Las células se pueden almacenar en PBS a 4 °C.

>2. Tinción de inmunofluorescencia

1. Prepare la solución de bloqueo: disuelva el 5% de BSA (p/v) en PBS y agregue el 0,3% (v/v) de Triton X-100. Mezcle hasta que se disuelva por completo.
2. Prepare el tampón de dilución: disuelva el 1% de BSA (p/v) en PBS y añada el 0,3% (v/v) de Triton X-100. Mezcle hasta que se disuelva por completo.
3. Para el bloqueo, agregue 200 μL de solución de bloqueo a cada pocillo. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente o 16-18 horas a 4 °C.
   nota: Si se va a utilizar anticuerpo de cabra, agregue suero de cabra al 5% a la solución bloqueante.
4. Diluya el anticuerpo primario en tampón de dilución (1:500; consulte la tabla 1 para la lista de anticuerpos) y el vórtice hasta que esté bien mezclado.
   nota: Si se utiliza anticuerpo de cabra, añadir un 1% de suero de cabra al tampón de dilución.
5. En una caja de humedad/incubación, adhiera un trozo de parafilm. Añadir 10 μL de anticuerpo primario (en una sola gota). Alinee un borde del cubreobjetos con la gota y baje lentamente sobre el parafilm, para que el líquido se extienda por todo el cubreobjetos (evite las burbujas si es posible). Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
6. Lave los cubreobjetos tres veces en PBS durante 1 minuto.
7. Diluya el anticuerpo secundario en tampón de dilución (concentración final: 2 μg/mL) y vórtice hasta que esté bien mezclado.
8. Aplique 10 μL de anticuerpo secundario como se describe para los anticuerpos primarios. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
   nota: Protégete de la luz.

Tabla 1: Anticuerpos utilizados. Lista de anticuerpos utilizados en este estudio.

9. Lave los cubreobjetos tres veces en PBS durante 1 minuto.
10. Lave los cubreobjetos con H₂O durante 1 minuto.
11. Contratinción de ADN con DAPI: aplicar 10 μL de DAPI de 300 nM (como se describe para los anticuerpos), incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego montar en un portaobjetos de vidrio con un medio de montaje a base de glicerol. Alternativamente, agregue una gota (10 μL) de medio de montaje comercial antidecoloración que contenga DAPI en un portaobjetos y aplique un cubreobjetos. Presione suavemente el cubreobjetos y elimine el exceso de líquido a su alrededor con una toalla de papel.
12. Sella los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y déjalos secar durante 20 minutos.
13. Guarde los portaobjetos a 4 °C.

3. Adquisición de imágenes

1. Coloque una gota de aceite de inmersión en la lente del objetivo de 60x. Utilice DAPI para localizar los núcleos a través del ocular.
   1. Para la adquisición de imágenes XYZ, abra el software de adquisición y seleccione los parámetros: Tipo de escáner: Galvano; Modo de escáner: Ida y vuelta; Tamaño de la imagen: 512×512; Modo PMT: VBF; Promedio PMT: marco (4 veces); Escaneo secuencial PMT: línea.
   2. Seleccione el tinte y los detectores:
      Canal (CH1), Colorante (DAPI), Detector (SD1)
      Canal (CH2), Tinte (Alexa Fluor 488), Detector (HSD3)
      Canal (CH3), Colorante (Alexa Fluor 647), Detector (HSD4)
   3. Seleccione ON en "Z".
2. Ajuste la imagen en vivo. Presione el botón En vivo en la ventana En vivo.
   1. Ajuste el enfoque y establezca la intensidad del láser (%), la sensibilidad (HV), la ganancia y el desplazamiento en la ventana de herramientas "PMT".
      1. Ajuste la intensidad del láser (%): para brillo y blanqueo. Cuanto mayor sea la intensidad del láser, más fuerte será la señal, pero la muestra se fotoblanqueará.
      2. Ajuste la sensibilidad (HV): nivel de ruido. Cuanto más alto sea el HV, más fuerte será la señal, pero la imagen será ruidosa si es demasiado alta.
         NOTA: Mantenga siempre el voltaje constante.
      3. Ajuste el nivel de fondo de desplazamiento: .
   2. Seleccione Inicio/Fin (15 segmentos) para las pilas Z.
3. Inicie la adquisición.
   1. Seleccione la carpeta para guardar las imágenes. Presione el botón Inicio de LSM para comenzar a adquirir la imagen. Presione el botón Series Done para completar la adquisición de la imagen.

Figura 1. Extracción nuclear.

Imágenes representativas de células antes (izquierda) y después (derecha) de la extracción nuclear. El citoplasma debe ser digerido, pero la estructura nuclear debe permanecer intacta después de la extracción (derecha). (A) Aumento de 20x; barra de escala = 20 μm y (B) aumento de 40x; Barra de escala = 10 μm.