Ensayo de arn-proteína para aislar proteínas de unión a ARN mediante extracción por afinidad

1. Preparación de la fracción de proteína citosólica y nuclear

1. Placa 4 x 10⁶ células ACC-MESO-4 en un matraz de cultivo celular T150 cultivado en medio RPMI - 1640 suplementado con 10% de FBS, 1x penicilina/estreptomicina (100x) y 2 mM de L-glutamina (200 mM). Cuando las células alcanzan una confluencia del 80-90% (~5-5,5 x 10⁶ células), se procede a la extracción de proteínas de las fracciones nuclear y citosólica.
   nota: La línea celular ACC-MESO-4 se obtuvo del Centro de Recursos Biológicos RIKEN.
2. Aspire el medio, lave las células agregando 15 mL de 1x PBS, incline la placa suavemente unas cuantas veces y aspire 1x PBS. Añadir 3 mL de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar el matraz de cultivo a 37 °C durante 3 min.
   nota: Observar las células bajo el microscopio para ver si hay desprendimiento; Si aún está colocado, golpee el matraz contra la palma de una mano 3 veces.
3. Agregue 7 mL de medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 1x penicilina/estreptomicina (100x) y 2 mM de L-Glutamina (200 mM), recoja las células en un tubo de 15 mL y centrifuga a 200 x g durante 5 min.
4. Aspire el medio y vuelva a suspender el pellet de celda con 1,5 mL de 1x PBS, luego transfiera las celdas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Girar a 500 x g y 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
   nota: A partir de este paso, realice todos los pasos de centrifugación a 4 °C y mantenga todos los reactivos en hielo.
5. Vuelva a suspender el pellet de celda con 1,5 mL de 1x PBS helado y centrifugar las celdas a 500 x g y 4 °C durante 3 min. Deseche el sobrenadante.
   nota: Las cantidades requeridas de reactivos CER I, CER II y NER son 10, 0,55 y 5 volúmenes de volumen estimado de pellets celulares, respectivamente; el siguiente protocolo supone un volumen de 20 μL. Recomendamos preparar solo la cantidad necesaria de reactivo CER I.
6. Añadir 200 μL de reactivo de extracción citoplasmática helado (CER I) suplementado con 2 μL de inhibidor de la proteinasa 1x, por ejemplo, diluir 1 comprimido de inhibidor de la proteasa (sin EDTA) en 500 μL de agua para obtener 100x caldo. Esta cantidad de reactivo CER I es suficiente para lisar 20 μL de un volumen de pellets de celda.
   1. Para estimar el volumen empaquetado de gránulos de celdas, compare el tubo que contiene el gránulo de celdas con un tubo de 1,5 ml lleno de 10, 20, 50 o 100 μL de 1x PBS.
7. Vuelva a suspender el gránulo celular agitando vigorosamente el tubo durante 15 s e incube el tubo en hielo durante 10 min. Añada 11 μL de reactivo de extracción citoplasmática II (CER II) frío al tubo, vórtice vigorosamente durante 5 s, e incube durante 1 min en hielo.
8. Agite enérgicamente el tubo durante 5 s y centrifugar el tubo a 16.000 x g y 4 °C durante 5 min. Transfiera el sobrenadante al tubo limpio preenfriado con hielo. El sobrenadante es la fracción citoplasmática que se utiliza posteriormente en el experimento de extracción de ARN.
9. Vuelva a suspender el pellet restante en 100 μL de reactivo de extracción nuclear (NER) helado suplementado con 1 μL de inhibidor de la proteinasa (100x) y vórtice vigorosamente durante 15 s. Recomendamos preparar solo la cantidad necesaria de reactivo NER suplementado con inhibidores de la proteasa.
10. Incubar la muestra en hielo durante 40 min con vórtices ocasionales durante 15 s (cada 10 min).
11. Centrifugar el tubo a 16.000 x g durante 10 min. Transfiera el sobrenadante (es decir, la fracción de proteína nuclear) a un tubo limpio y preenfriado.
12. Proceda inmediatamente a medir la concentración de proteínas utilizando el método bicincónico (BCA) (ver Tabla de Materiales). Para controlar la pureza proteica de cada fracción, se debe realizar inmunotransferencia (Figura 1) contra α-tubulina (detección positiva solo en la fracción citosólica) y poli ADP-ribosa polimerasa - PARP (detección positiva solo en la fracción nuclear).
13. Para mantener la actividad de las proteínas y su estado nativo, prepare 25 μL de alícuotas de extractos citosólicos y nucleares. Congele rápidamente estas alícuotas colocándolas en nitrógeno líquido durante 5 s y almacene directamente a -80 °C.

>2. Marcaje de ARN con destiobiotina

1. Sintetizar comercialmente las sondas de ARN y purificarlas por HPLC. Vuelva a suspender con agua sin nucleasas a 10 μM.
   nota: Las secuencias de sonda se enumeran en la Tabla 1.
2. Utilice 50 pmol de ARN por reacción de extracción de ARN. Descongele y mantenga todos los reactivos en hielo, excepto el PEG 30%, que se utiliza para marcar el extremo 3' del oligonucleótido de ARN.
3. Transfiera 5 μL de sondas de ARN de 10 μM, marcadas como CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) y Nonrelated-RNA (IRE), a tubos de microcentrífuga de pared delgada de 0,5 mL e incube en una máquina de PCR a 85 °C durante 5 min. Coloque los tubos inmediatamente sobre hielo.
   nota: Este paso es importante, ya que promueve la relajación y la accesibilidad de la sonda de ARN para el etiquetado.
4. Para una sola reacción de 30 μL, agregue al tubo que contiene ARN la siguiente mezcla de 10 μL: 3 μL de agua libre de nucleasa, 3 μL de tampón de reacción de ARN ligasa 10x, 1 μL de inhibidor de ARNasa (40 U/μL), 1 μL de bisfosfato de citidina destiobiotinilado (1 mM) y 2 μL de ARN ligasa T4 (20 U/μL).
   nota: Para preparar una mezcla maestra A para 3 muestras en exceso (3,2), mezcle 9,6 μL de agua libre de nucleasas, 9,6 μL de tampón de reacción de ARN ligasa 10x, 3,2 μL de inhibidor de ARNasa (40 U/μL), 3,2 μL de bifosfato de citidina destiobiotinilado (1 mM) y 6,4 μL de ARN ligasa T4 (20 U/μL).
5. Añadir con cuidado 15 μL de PEG 30% a la reacción. Usa otra punta para mezclar la reacción. Incubar la reacción durante la noche a 16 °C.
6. Al día siguiente, prepare lo siguiente: 5 M de NaCl (fresco/sin nucleasas), cloroformo: alcohol isoamílico en proporción 24:1 (por ejemplo, por reacción: 96 μL de cloroformo y 4 μL de alcohol isoamílico), etanol 100% helado y etanol 70% helado.
7. Añada 70 μL de agua libre de nucleasas a los tubos de reacción de marcado de ARN. Añadir 100 μL de cloroformo: alcohol isoamílico y vórtice brevemente. Centrifugado a 13.000 x g durante 3 min. Retire con cuidado SOLO la fase superior y transfiérala a un nuevo tubo de 1,5 ml sin nucleasas; Evite tocar la fase inferior.
8. Agregue 10 μL de NaCl 5 M, 1 μL de glucógeno y 300 μL de etanol 100% helado. Coloque el tubo a -20 °C durante 2 h.
   nota: En este paso, el experimento puede continuar al día siguiente.
9. Centrifugar a 13.000 x g y 4 °C durante 15 min. Deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. Añadir 300 μL de etanol al 70% helado y volver a centrifugar a 13.000 x g y 4 °C durante 5 min.
10. Deseche el sobrenadante por completo y seque el pellet al aire (15 min). Vuelva a suspender el pellet en 20 μL de agua libre de nucleasas.
    nota: Proceda con la extracción de ARN el mismo día.
11. Incubar el ARN a 90 °C durante 2 min y colocarlo en hielo. Coloque el ARN marcado en el hielo durante el siguiente paso de prelavado de las perlas magnéticas de estreptavidina.
    nota: Un tiempo de incubación más largo puede dañar la sonda de ARN.

>3. Extracción de ARN-proteína

1. Prelavado de estreptavidina-perlas magnéticas e incubación con destiobiotina-ARN
   1. Utilice 50 μL de perlas magnéticas de estreptavidina por cada 50 pmol de ARN. Sin embargo, esto debe optimizarse en función del experimento.
   2. Agite el tubo con perlas magnéticas de estreptavidina durante 15 s y extraiga rápidamente 200 μL (mezcla maestra; suficiente para 3+1 reacciones) en un tubo limpio de 1,5 mL con cierre seguro utilizando puntas de pipeta cortadas. Coloque el tubo en un soporte magnético para que las cuentas se acumulen en el costado del tubo y espere 1 minuto. Retire el líquido de resuspensión.
   3. Para lavar las perlas, retire el tubo del soporte magnético, agregue 400 μL de solución de NaOH 0,1 M y NaCl 0,05 M, y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Vuelva a colocar el tubo en el soporte magnético. Espere 1 min y recoja el sobrenadante. Repita este paso de nuevo.
   4. Lavar las perlas con 200 μL de 100 mM de NaCl. Retire el sobrenadante.
   5. Añadir 200 μL de Tris 20 mM (pH 7,5), resuspender las perlas mediante pipeteo, colocar el tubo en el soporte magnético, esperar 1 min y retirar el sobrenadante. Repita el paso.
   6. Retire el tubo del soporte magnético, agregue 200 μL de tampón de captura de ARN 1x y vuelva a suspender las perlas magnéticas de estreptavidina mediante un breve vórtice. Retire 50 μL de perlas magnéticas de estreptavidina y agréguelas a cada tubo de ARN marcado con una punta de pipeta cortada. Incubar los tubos durante 30 min a temperatura ambiente en un rodillo.
2. Unión de la proteína al ARN
   1. Coloque los tubos en un soporte magnético, espere 1 minuto y retire el sobrenadante.
   2. Añadir 50 μL de 20 mM de Tris (pH 7,5) a las perlas y volver a suspender mediante pipeteo. Coloque los tubos en un soporte magnético, espere 1 minuto y retire el sobrenadante. Repita este paso.
   3. Añada 100 μL de tampón de unión proteína-ARN 1x a las perlas y vuelva a suspender mediante pipeteo.
   4. Mientras tanto, prepare la siguiente mezcla: 10 μL de tampón de unión proteína-ARN 10x, 30 μL de glicerol al 50%, 50 μg de proteínas citoplasmáticas y agua sin nucleasas hasta 100 μL.
      nota: Prepare una mezcla maestra B para 3 muestras en exceso (3.3) de la siguiente manera: 33 μL de tampón de unión proteína-ARN 10x, 99 μL de glicerol al 50%, 165 μg de proteínas citoplasmáticas y agua libre de nucleasas hasta 330 μL. Mantenga el tubo de la mezcla maestra B en hielo.
   5. Coloque los tubos en el soporte magnético, espere 1 minuto y recoja el sobrenadante. Añadir 100 μL de mezcla maestra B, volver a suspender pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, y evitar la formación de burbujas. Incubar los tubos de reacción durante 60 min a 4 °C en un rodillo.
3. Lavado y elución
   1. Coloque los tubos en un soporte magnético, recoja el sobrenadante (que es el flujo a través de - FT) y transfiéralo a un nuevo tubo.
      nota: Mantenga este FT en hielo para su posterior análisis.
   2. Pipetear 100 μL de 1x Tampón de lavado en las perlas, volver a suspender suavemente, volver a colocar en el soporte magnético, esperar 1 minuto y desechar el sobrenadante. Repita este paso 2 veces.
   3. Añadir 40 μL de tampón de elución a las perlas magnéticas, mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar a 37 °C en un agitador de tubos (950 rpm) durante 30 min.
   4. Coloque los tubos en un soporte magnético, espere 1 minuto y recoja la muestra eluida (que es eluida - E). Colocar en hielo y utilizar para análisis posteriores.
      nota: En este paso, cada sonda de ARN analizada consta de una muestra de flujo continuo (FT) y una muestra eluida (E).

Figura 1: Análisis de Western blot de 5 μg de fracción de proteína citosólica y nuclear. La proteína PARP está presente en la fracción nuclear (N) pero ausente en la fracción citosólica (C). α-tubulina está presente en la fracción citosólica (C) pero ausente en la fracción nuclear (N).

Tabla 1: Secuencias de sondas de ARN