Ensayo de arn-proteína para aislar proteínas de unión a ARN mediante extracción por afinidad

Resumen

Fuente: Kresoja-Rakic, J., et al. Purificación mediada por afinidad por destiobiotina-estreptavidina de proteínas que interactúan con ARN en células de mesotelioma. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra un ensayo de extracción de ARN in vitro para identificar proteínas de unión a ARN (RBP), que interactúan con las secuencias de elementos ricos en adenilato-uridilato (ARE) en el ARNm. Las RBP diana de un lisado celular se mezclan con una sonda de ARN para formar complejos de ARN-proteína. Los complejos se aíslan mediante purificación por afinidad utilizando la afinidad de la marca de destiobiotina de la sonda de ARN a una perla magnética marcada con estreptavidina.

Protocolo

1. Preparación de la fracción de proteína citosólica y nuclear

1. Placa 4 x 10⁶ células ACC-MESO-4 en un matraz de cultivo celular T150 cultivado en medio RPMI - 1640 suplementado con 10% de FBS, 1x penicilina/estreptomicina (100x) y 2 mM de L-glutamina (200 mM). Cuando las células alcanzan una confluencia del 80-90% (~5-5,5 x 10⁶ células), se procede a la extracción de proteínas de las fracciones nuclear y citosólica.
   nota: La línea celular ACC-MESO-4 se obtuvo del Centro de Recursos Biológicos RIKEN.
2. Aspire el medio, lave las células agregando 15 mL de 1x PBS, incline la placa suavemen....

Resultados

Figura 1: Análisis de Western blot de 5 μg de fracción de proteína citosólica y nuclear. La proteína PARP está presente en la fracción nuclear (N) pero ausente en la fracción citosólica (C). α-tubulina está presente en la fracción citosólica (C) pero ausente en la fracción nuclear (N).

Tabla 1: Secuencias de sondas de ARN

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NE-PER Kit de extracción nuclear y citoplasmática	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Tabletas Inhibidoras de la Proteasa, sin EDTA	Thermo Fisher Scientific	A32965
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA	Thermo Fisher Scientific	23225
Kit Pull-Down de ARN-Proteína Magnética Pierce	Thermo Fisher Scientific	Año 20164	Incluye perlas magnéticas y, por lo tanto, el kit debe almacenarse a 4 °C
Kit de destiobiotinilación Pierce RNA 3' End	Thermo Fisher Scientific	20163	El kit forma parte del "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" y debe almacenarse a -20 °C, a diferencia del kit desplegable (4 °C).
DynaMag-2, soporte magnético	Thermo Fisher Scientific	12321D
RPMI - 1640 medio	Sigma-Aldrich	R8758
FBS - Suero Bovino Filtrado	Pan Biotecnología	P40-37500
Penicilina - estreptomicina (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
Solución de L-glutamina (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0,25% Tripsina-EDTA (1x)	Tecnologías Gibco by Life	25200-056
Solución de descontaminación de RNasa RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Síntesis de oligonucleótidos de ARN	Mycrosynth AG, Suiza	-	La escala de síntesis - 0,04 μmol - Purificada por HPLC
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7030
Ácido clorhídrico (HCl) 6 m	PanReac AppliChem	182883.1211
Tris ultra puro de 1 m, pH 7,5	Thermo Fisher Scientific	15567027
glicerol	Thermo Fisher Scientific	Año 17904	50% de alícuotas estériles para almacenar a -20 °C
Perlas magnéticas Pierce Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	88817	Tenga en cuenta que estas perlas magnéticas tienen un diámetro medio de 1 μm (rango de 0,5 a 1,5 μm). Además, la estreptavidina Dynabeads-M280, que son perlas de un tamaño homogéneo de 2,8 μm, también se utilizan en la extracción de ARN, pero tenga en cuenta que esto puede afectar el proceso de purificación.
Sulfato de aluminio-(14-18)-hidrato	Sigma-Aldrich	368458
Ácido ortofosfórico	Applichem	A0637