Ensayo de unión in vitro basado en SELEX para identificar interacciones ARN-proteína

1. Reacción de unión a proteínas y separación del ARN unido

1. Llevar a cabo la unión de proteínas y ARN en 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5 en un volumen de 100 μL añadiendo los siguientes ingredientes a estas concentraciones finales: 50 mM de KCl, 1 mM de DTT, 0,09 μg/μL de albúmina sérica bovina, 0,5 unidades/μL de ARNasina, 0,15 μg/μL de ARNt, 1 mM de EDTA, y 30 μL de concentración apropiada de proteína recombinante (PTB). Agregue ARN del grupo apropiado.
   nota: El factor de empalme U2AF65 generalmente se une a los sitios de empalme del tracto de polipirimidina/3' de los intrones modelo con una afinidad de unión (constante de disociación de equilibrio o K_d) de aproximadamente 1-10 nM. Por lo tanto, las dos primeras rondas de unión utilizaron una concentración de proteína 10 veces superior a la K_d para U2AF65; para las proteínas SXL y PTB, la concentración inicial en este rango fue solo nuestra mejor estimación. Esto garantizó que las especies de ARN deseadas pudieran unirse, aunque las secuencias de menor afinidad también estaban potencialmente unidas. En las rondas 3 y 4 (transcripción, unión y amplificación), la concentración de proteínas se redujo tres veces. Esto se hizo para eliminar con éxito las especies de ARN de baja afinidad.
2. Coloque los tubos que contienen las reacciones de unión durante unos 30 minutos a 25 °C en un bloque de temperatura (o sobre hielo).
3. Fraccione el ARN unido del ARN no unido durante las primeras 4 rondas de selección-amplificación siguiendo los siguientes pasos.
   1. Filtre la muestra (100 μL) a temperatura ambiente a través de un filtro de nitrocelulosa conectado a un colector de vacío.
      nota: El complejo ARN-proteína, pero no el ARN no unido, permanece en el filtro.
   2. Pica el filtro con el ARN retenido en fragmentos con una cuchilla de afeitar estéril e insértalos en un tubo de centrífuga. Recupere el ARN girando el tubo suavemente durante un mínimo de 3 h (o toda la noche) con las piezas de filtro sumergidas en el tampón de proteinasa K (PK).
   3. Desproteinizar la muestra de ARN mediante vórtice en presencia de un volumen igual de fenol-cloroformo (1:1) y luego de cloroformo. Recupere la fase acuosa cada vez centrifugando la muestra a alta velocidad durante 5 min a temperatura ambiente.
   4. Mézclalo con acetato de sodio (0,1 volumen de 3,0 M, pH 5,2) y etanol (2-3 volúmenes de etanol absoluto, 200 grados). Dejar el tubo en un congelador a -80 °C durante 30 min, centrifugarlo a alta velocidad durante 10 min, y, siguiendo las etapas de lavado y secado, solubilizar el ARN en agua tratada con DEPC.
4. Separe las fracciones de ARN unidas a proteínas de las fracciones no unidas para las últimas 2 rondas (rondas 5 y 6; transcripción, unión y amplificación) de la siguiente manera. Reduzca la concentración de proteínas en la reacción de unión (paso 1.1) tres veces más para obtener una presión de selección adicional para enriquecer las secuencias de unión de alta afinidad y eliminar preferentemente las secuencias de baja afinidad.
   1. Prefabricar un gel de poliacrilamida nativo (5% con una relación de acrilamida:bis-acrilamida de 60:1) en tampón TBE 0,5x (Tris-Borato-EDTA) antes de configurar la reacción de unión a ARN:proteína anterior (paso 1.1). Electroforesar este gel en una cámara frigorífica (4 °C) aplicando 250 V durante 15 min.
   2. Pipetear las reacciones de unión a proteínas ARN:proteínas anteriores (paso 1.1) en diferentes pocillos de este gel.
      nota: La proteína se almacena a -80 °C y se diluye antes de su uso en 20 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES), pH 8,0, 20% glicerol, 0,2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,05% NP-40 y 1 mM de ditiotreitol (DTT). La adición de fluoruro de fenilmetano sulfonilo (PMSF), inhibidor de la proteasa de 0,5-1,0 mM, es opcional. En la reacción de unión, este tampón aporta aproximadamente un 6% de glicerol, lo que permite la carga directa de muestras en los pocillos sin necesidad de mezclarlas con un tampón de carga de gel separado.
   3. Fraccionar el ARN unido del ARN no unido mediante electroforesis en gel en una cámara frigorífica (4 °C) a 250 V durante 1 a 2 h. Este proceso también se conoce como ensayo de cambio de movilidad en gel.
      NOTA: La duración de la electroforesis varía en función de las características del ARN y la proteína utilizada para la unión.
   4. Exponga el gel a una película de rayos X e identifique la ubicación del ARN unido mediante autorradiografía. Corta la rodaja de gel con el ARN unido e insértala en un tubo.
   5. Incubar la rodaja de gel triturada en el tampón PK utilizado para la elución durante 3 h o toda la noche.
   6. Agite vigorosamente la muestra de ARN eluido primero con fenol-cloroformo y luego con cloroformo.
   7. Mezcle acetato de sodio y etanol con la fase acuosa después de la extracción con cloroformo. Después de la incubación en un congelador a -80 °C, centrifugar a 4 °C durante 5-10 minutos para recoger la pastilla de ARN. Lave el pellet de ARN con etanol y séquelo al aire dejando la tapa del tubo abierta. Disolver el ARN en agua tratada con DEPC.
      nota: El cambio al ensayo de cambio de movilidad en gel para el fraccionamiento permite la eliminación de especies de ARN no deseadas que podrían haberse enriquecido para unirse, por ejemplo, al filtro de nitrocelulosa aquí (o a cualquier matriz) utilizado en las rondas iniciales para el fraccionamiento.

>2. Transcripción inversa y amplificación por PCR

1. Sintetice ADNc a partir del ARN disuelto utilizando transcriptasa inversa y el cebador inverso incubando la reacción de 20 μL (2 μL de tampón RT 10x, 2 μL de transcriptasa inversa AMV, 1 μM de cebador inverso, 10 μL de ARN, inhibidor de RNasa opcional) a 42 °C durante 60 min.
2. Amplifique el ADNc utilizando 20-25 ciclos de PCR. Adjunte el promotor de ARN polimerasa T7 a la biblioteca mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que contenga 1 μM de plantilla de biblioteca aleatoria de ADN, 1 μM de cada cebador, 20 mM de Tris (pH 8,0), 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, 0,1 μg/μL de albúmina sérica bovina acetilada, 2 unidades de polimerasa Taq y 200 μM de dNTP (desoxiguanosina, desoxiadenosina, desoxicitidina y trifosfato de desoxitimidina).

3. Transcripción y unión a proteínas

1. Repita el proceso de síntesis de ARN, unión a proteínas y separación de fracciones unidas y no unidas a proteínas.