Termoforesis a microescala para estudiar las interacciones proteína-lípidos en solución

Resumen

Fuente: Sparks, R. P. et al., Uso de termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido.J. Vis. Exp.(2022)

Este video muestra la termoforesis a microescala para estudiar la interacción proteína-lípido. El ensayo detecta la interacción entre moléculas cuantificando el movimiento termoforético de las proteínas marcadas con fluorescencia en respuesta a un gradiente de temperatura. La molécula fluorescente se mezcla con diferentes concentraciones de moléculas lipídicas no fluorescentes, y la mezcla de moléculas en la solución se carga en capilares. Se aplica un gradiente de temperatura a las muestras en los capilares, y se detecta y registra el movimiento de la molécula fluorescente en el gradiente de temperatura.

Protocolo

1. Preparación de materiales

1. Preparación de solución salina tamponada con fosfato (PBS): 137 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de NaH₂PO₄ y 2 mM de KH₂PO_4, pH 7,4.
2. Prepare el tinte NTA-Atto 647 N. Diluya el colorante NTA-Atto 647 N a 100 nM a partir de una solución 100% DMSO en PBS sin interpolación.
3. Express Vam7-His8 – Proteína como proteína de fusión en E. coli y purifique mediante Ni-NTA y cromatografía de exclusión por tamaño.
4. Valorar el analito en tampón PBS. Si el analito está en un tampón diferente, el MST marcado no es particularmente sensible a las diferencias menores de tampón con moléculas como el DMSO, a menos que el contenido del tampón del analito interactúe con la proteína marcada.

>2. Preparación del dispositivo MST

1. Encienda el interruptor de encendido en la parte posterior del dispositivo.
2. Abra el software de control y asegúrese de que la computadora portátil esté encendida y en estado conectado en la computadora conectada al dispositivo.
3. Introduzca los ajustes de fluorescencia y MST para este experimento. Establezca MST Antes en 3 s, MST en 30 s y Recuperación de fluorescencia (Fluo.)después de 1 s. Antes mide la fluorescencia inicial y no requiere largos tiempos; MST es la cantidad real de tiempo para que se alcance el equilibrio después de la inducción de calor.
4. Tabla de capilares: Para cada tubo capilar, introduzca el nombre del objetivo (ligando), el nombre del ligando (analito), la concentración del objetivo y la concentración de valoración más alta y utilice la relación de valoración de autorrelleno. Por ejemplo, introduzca 50 nM para la concentración objetivo de Vam7-His8, Vam7-His8 para el nombre objetivo, (ácido 1,2-dioctanoyl fosfatídico) Di-C8 PA para el nombre del ligando, y la concentración más alta del ligando seleccionando 1:1 y arrastrando hacia abajo hasta las ranuras de autocompletar 2-16.
5. Ejecute un escaneo de tapón para seleccionar el LED apropiado (20% de LED (preestablecido)) en función de la señal de la proteína objetivo y ajuste entre 200 y 2000 unidades de fluorescencia para MST marcado. Los escaneos de tapón deben mostrar picos redondeados uniformes en forma de campana.
6. Seleccione un rango de potencias MST e ingrese los valores de cada una para probar el ajuste de unión más robusto y presione Iniciar escaneo de tapa + Medición, escaneando diferentes valores para determinar las mejores condiciones de funcionamiento para la interacción dada que se está probando.
7. Determine la potencia MST con el mejor ajuste utilizando el software de análisis y el preajuste para termoforesis con Tjump. Analice los ajustes de acuerdo con la mayoría de la separación de fluorescencia entre la concentración más baja y la más alta en comparación con la potencia MST con el mejor ajuste y seleccione la potencia MST para ensayos replicados.
8. Determine si se ha producido un fotoblanqueo entre la primera y la segunda ejecución yendo al software de análisis y cambiando el análisis al modo experto. A continuación, seleccione fluorescencia en lugar de termoforesis para el análisis. Seleccione el modo experto y luego el fotoblanqueo.

>3. Preparación de muestras para MST marcado

1. Lleve la solución Vam7-His8 a una concentración de 200 nM en PBS sin interpolación.
2. Lleve el tinte NTA-Atto 647 a 100 nM en PBS sin interpolación.
3. Mezcle el colorante Vam7-His8 y NTA-Atto 647 en una proporción volumétrica de 1:1 y déjelo reposar a temperatura ambiente cubierto de luz durante 30 min. Determine la concentración adecuada de la proteína objetivo como en la sección 2.5 (consulte el Suplemento sobre la utilización de KD del colorante Ni-NTA como se muestra en el video).
4. Centrifugar la mezcla de tinte NTA-Atto 647 N y proteína durante 10 minutos en una habitación oscura utilizando una centrífuga de mesa a aproximadamente 8.161 x g.
5. Almacene la mezcla a 4 °C después del experimento o en hielo durante el experimento para reutilizarla en unas pocas horas si es necesario para evitar que las proteínas se desnaturalicen.
6. Utilice el buscador de concentración NT para determinar el rango de concentración necesario para la valoración.
7. Lleve Di-C8 PA a la concentración máxima adecuada en agua.
8. Valore el analito utilizando una dilución en serie 1:1 en tampón PBS durante 16 concentraciones según el paso anterior. A diferencia de la SPR, la termoforesis no es tan sensible a las diferencias de tampón.

>4. MST de muestras

1. Encienda el dispositivo y la computadora portátil conectada.
2. Presione la flecha hacia arriba en la parte delantera de la máquina y deslice la rejilla capilar hacia afuera.
3. Cargue los capilares en la rejilla con la concentración más alta en la posición 1.
4. En el software de control, seleccione el canal rojo correspondiente a NTA-Atto 647 N.
5. Introduzca la información de concentración, posición y nombre de cada capilar en la Tabla de capilares.
6. Ejecute un escaneo capilar presionando Iniciar escaneo de tapa al 20% de LED (preestablecido) y ajuste en consecuencia entre 200 y 2000 unidades de fluorescencia utilizando la configuración de intensidad de LED o la concentración de ligando (proteína marcada).
7. Seleccione un rango de potencia MST.
8. Inicie el escaneo de la tapa + la medición MST.
9. Analice utilizando el software de análisis.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cy5 Maleimida Colorante Mono-Reactivo	GE Cuidado de la Salud	PA23031	Para el etiquetado de proteínas
Prisma GraphPad	Software GraphPad
Monolito NT.115 Capilares (1000 unidades)	Nanotemple	MO-K022	Capilares para MST
Máquina monolítica NT.115	Nanotemple		Equipamiento universitario
NTA-ATTO 647 N	sigma	Año 2175	Etiqueta para Sus etiquetas
Fosfatidilinositol 3-fosfato diC8 (PI(3)P diC8)	escalón	P-3008	Lípidos para experimentos de unión