Citometría de flujo cuantitativa para estudiar las interacciones proteína-vesículas de fosfolípidos marcadas

Resumen

Fuente: Podoplelova, N. et al., Análisis de la interacción de proteínas marcadas con fluorescentes con microvesículas de fosfolípidos artificiales mediante citometría de flujo cuantitativa. J. Vis. Exp. (2022)

En este video, demostramos la interacción entre proteínas y vesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa. La unión de proteínas marcadas con fluorescencia a vesículas de fosfolípidos marcadas con fluorescencia aumenta la intensidad media de fluorescencia, y este aumento se detecta mediante un citómetro de flujo.

Protocolo

1. Detección de la interacción proteína-lípido mediante citometría de flujo

1. Experimentos de enlace cinético
   1. Diluir vesículas de fosfolípidos en tampón Tyrode (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glucosa, 0,5% BSA, pH 7,4) hasta una concentración de 1 μM y un volumen total de 250 μL.
   2. Mezclar el factor de coagulación X marcado con fluorescencia (fX-fd) del paso 1 a una concentración de 500 nM con las vesículas de fosfolípidos del paso 1.1.1 en una proporción de 1:1 (concentración final de vesícula de 0,5 μM, la concentración de fX-fd es de 250 nM de fX) hasta un volumen total de 500 μL.
   3. Inyecte inmediatamente los 500 μL de la suspensión mixta (~20 min para el análisis con una tasa de flujo baja) en el citómetro de flujo. Utilice un caudal bajo y asegúrese de que el umbral para el canal FL2 (excitación 488 nm, filtro de emisión 585/42 nm) sea el valor 200. Mida la fluorescencia media en el canal FL4 (excitación 633 nm, filtro de emisión 660/20) para el colorante de fluorescencia de la Tabla de Materiales.
      nota: Elija un citómetro sin muestreador automático. Esto acelerará el proceso de inyección de la muestra en la celda de medición.
   4. Cuando se logre la saturación de la unión (sin un aumento significativo de la fluorescencia en 5 minutos), diluya rápidamente la muestra 20 veces con el tampón de Tyrode y controle la disociación hasta que se alcance la fluorescencia basal (disociación completa) o hasta que se alcance una meseta (sin una disminución significativa de la fluorescencia dentro de los 5 minutos)
      nota: Como control, agregue 10 μM de EDTA y controle la disociación completa durante 5 minutos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 647 NHS Éster (éster de succinimidilo)	Thermo Fisher Scientific	A37573	Tinte fluorescente
BD FACSCantoII	BD Biociencia
DiIC16(3) (1,1'-dihexadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato)	Thermo Fisher Scientific	D384	Tinte fluorescente
Dmso	Sigma Aldrich	D8418
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
L-α-fosfatidilserina (cerebro, cerdo) (sal sódica)	Lípidos polares de Avanti	840032P
L-α-fosfatidilcolina (cerebro, porcino)	Lípidos polares de Avanti	840053P
Mini-Extrusora	Lípidos polares de Avanti	610020-1EA
Cloruro de potasio	Sigma Aldrich	P9541-500G
Cloruro de calcio, anhidro, en polvo, ≥97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Fosfato de sodio monobásico	Sigma Aldrich	S3139-250G
cloruro de sodio	Sigma Aldrich	S3014-500G
Cloruro de magnesio	Sigma Aldrich	M8266-100G
Albúmina sérica bovina	VWR Ciencias de la Vida AMRESCO	Am-O332-0.1
Sal disódica EDTA	VWR Ciencias de la Vida AMRESCO	Am-O105B-0.1