NOTA: Los tampones deben filtrarse con un filtro de 0,22 μm y desgasificarse al vacío durante 1 h.
>1. Preparación de vesículas lipídicas
- Utilice tubos de vidrio de 2 ml. Disuelva cada lípido, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS) y colesterol (Chol), en una mezcla de cloroformo/metanol (50:50 v/v) para preparar una solución lipídica clara de 5 mM. Disolver 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositol-4',5'-bisfosfato) (PI(4,5)P2) en una mezcla de cloroformo/metanol/agua (20:9:1 v/v).
- Combine los lípidos disueltos en la proporción molar deseada de POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20) y POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (Tabla 1) en tubos de vidrio de 10 mL.
nota: La cantidad final de lípidos totales es de 500 μg.
- Evapore los solventes orgánicos usando una corriente seca de nitrógeno. Dejar la mezcla lipídica en un sistema de alto vacío (liofilización) durante 3 h para eliminar cualquier rastro residual de los disolventes.
nota: Esto da como resultado una película clara y seca.
- Vuelva a suspender la película lipídica en 1 mL de tampón de citrato (10 mM de citrato trisódico, 150 mM de NaCl, pH 4,6). Incubar la suspensión lipídica a 60 °C (esta temperatura es de unos 10 °C por encima de la temperatura de transición de fase del lípido de fusión más alto de la mezcla) durante 30 min en un baño de agua, y vórdela vigorosamente cada 5 min.
nota: Esto da lugar a la formación de grandes vesículas multilaminares (MLV). Mantenga la suspensión por encima de la temperatura de transición.
- Precaliente el extrusor (a 60 °C en este caso) equipado con una membrana de policarbonato del tamaño de un poro de 50 nm de diámetro por encima de la temperatura de transición (que aquí es de 40 a 50 °C) durante 30 min.
- Cargue la suspensión MLV en la extrusora precalentada y pase suavemente la mezcla 31x a través de la membrana de policarbonato para formar pequeñas vesículas unilaminares (SUV). Mantenga la temperatura por encima de la temperatura de transición.
- Transfiera la suspensión del SUV a un recipiente de reacción de plástico de 2 mL y agregue el tampón de citrato (consulte el paso 1.4) para llevar el volumen final a 2 mL.
nota: Esto producirá una concentración final de lípidos de 250 μg/mL.
>2. Manejo de los sensores de cuarzo
NOTA: Manipule siempre los sensores de cuarzo con una pinza.
- Incubar cuatro sensores insertados en un soporte de politetrafluoroetileno en una solución SDS al 2% durante ≥ 30 min. Lávelos abundantemente con agua ultrapura para eliminar completamente el SDS y déjelos secar con un chorro de argón o nitrógeno seco.
- Utilice un sistema de limpieza con plasma para eliminar por completo cualquier contaminante. Inserte los sensores secos en la cámara de limpieza por plasma, evacúe la cámara y enjuáguela 3 veces con oxígeno. Encienda el limpiador de plasma. Utilice los siguientes parámetros de proceso: 1 x 10-4 Torr de presión, alta potencia de radiofrecuencia (RF) y 10 minutos de tiempo de proceso. Apague la máquina y saque los sensores.
3. Operación de microbalanza
NOTA: Se utilizó un sistema de microbalanza con cuatro cámaras de flujo controladas por temperatura en una configuración paralela, conectadas a una bomba peristáltica y ajustadas a un caudal de 80 μL/min. En el modo de flujo abierto, el tampón se bombeó desde el depósito de alimentación hasta el tanque receptor. En el modo de bucle, el tanque receptor se conectó al depósito de alimentación para generar un circuito cerrado. La temperatura se fijó en 20 °C.
- Acople con cuidado los sensores limpiados con plasma en las 4 cámaras de flujo, utilizando pinzas. Evite cualquier presión o torsión de las cámaras y los tubos que pueda causar fugas.
- Enjuague el sistema con tampón de citrato (10 mM de citrato de trisodio, 150 mM de NaCl, pH 4,6) en el modo de flujo abierto durante 10 min.
nota: Esto requiere exactamente 3,2 mL de tampón, pero es aconsejable utilizar un exceso de tampón (10 mL).
- Inicie el programa. Comience a registrar cualquier cambio en la frecuencia y la disipación del primer tono fundamental (n = 1º) y los armónicos (n = 3º - 13º) utilizando el software, hasta que las líneas de base de frecuencia y disipación sean estables (esto tomará alrededor de 40 - 60 min).
nota: Los niveles de ruido de frecuencia (pico a pico) deben ser inferiores a 0,5 Hz y, para la disipación, inferiores a 0,1,10-6, con una deriva máxima (en solución acuosa) de 1 Hz/h en frecuencia y de 0,3,10-6/h en disipación.
- Cuando las líneas de base sean estables, aplique la suspensión SUV en tampón de citrato (2 mL en un tubo pequeño). Con un recipiente de reacción, retire 1,5 mL del volumen muerto. A continuación, cierre el sistema en el modo de flujo de bucle. Registre el cambio de frecuencia/disipación durante otros 10 minutos.
nota: Durante este tiempo, las vesículas se extenderán sobre la superficie de SiO2 y se fusionarán para formar una bicapa continua (paso 2 en las Figuras 1, Figura 2 y Figura 3). La adsorción de los SUV en la superficie del sensor es bifásica y tiene una frecuencia mínima y máxima típica en la disipación. Una nueva línea de base estable de frecuencia/disipación con un cambio de frecuencia característico (dependiendo de la composición lipídica) de 26 a 29 Hz (ver Tabla 1) indica una bicapa continua en la superficie.
- Cuando el SLB esté estable (ver paso 3.4), equilibre el sistema con el tampón de funcionamiento (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4) a las concentraciones requeridas de Ca2+ (que van desde 50 μM hasta 1 mM CaCl2, dependiendo del experimento) en un modo de flujo abierto durante 40 min.
- Agregue la proteína (en este caso, AnxA2) al tampón de ejecución que contiene Ca2+ (consulte el paso 3.5). Realice la aplicación de la proteína en un modo de flujo de bucle hasta que se alcance un estado estacionario de equilibrio (paso 3 en la Figura 1, Figura 2 y Figura 3).
nota: La concentración de proteínas puede oscilar entre 1 y 400 nM. La adsorción de proteínas da lugar a un cambio de frecuencia dependiente de la concentración que refleja la adsorción de masa (proteína).
- Disociar la proteína unida quelando iones Ca2+ con 5 mM de EGTA en el tampón de funcionamiento en modo de flujo abierto (paso 4 en las Figuras 1 y 2).
nota: Una recuperación de la frecuencia y la disipación a la línea de base de SLB indica la reversibilidad total de la unión a proteínas. Los ciclos de asociación-disociación se pueden repetir para comparar diferentes concentraciones o proteínas.
