$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Imágenes de la formación de condensación de EWS-FLI1 en cortinas de ADN
- Abra el software de imágenes, encuentre y marque las posiciones de los 3 × 3 patrones en zig-zag bajo el campo claro.
- Abra el flujo a 0,2 mL/min para teñir el ADN con el tinte de ADN bicatenario durante 10 min.
- Diluya mCherry-EWS-FLI1 con el tampón de imagen hasta la concentración de 100 nM en 100 μL en el tubo.
- Cargue la muestra de proteína a través de la válvula con una jeringa de vidrio de 100 μL y cambie el caudal a 0,4 mL/min.
- Encienda el láser de 488 nm y escanee previamente cada región para verificar el estado de distribución del ADN; seleccione la región donde las moléculas de ADN se distribuyen uniformemente. Ajuste la potencia del láser al 10% para el láser de 488 nm y al 20% para el láser de 561 nm. Utilice el medidor de potencia para medir la potencia real del láser cerca del prisma: 4,5 mW para el láser de 488 nm y 16,0 mW para el láser de 561 nm.
- Adquisición de imágenes
- Comience a adquirir imágenes a intervalos de 2 s con láseres de 488 nm y 561 nm simultáneamente.
- Cambie la válvula del modo manual al modo de inyección para permitir que el tampón de imágenes enjuague la muestra de proteína en la celda de flujo después de 60 s.
nota: Este proceso tomará ~ 30 s, y el campo de visión se cubrirá con señales mCherry tan pronto como las proteínas EWS-FLI1 lleguen a la celda de flujo.
- Para eliminar el EWS-FLI1 libre, siga lavando la celda de flujo con el tampón de imagen durante 5 minutos con solo el láser de 561 nm encendido. Detenga el flujo e incube a 37 °C durante 10 min.
- Abra el flujo a 0,4 mL/min para permitir que el ADN se extienda, y adquiera imágenes a intervalos de 2 s entre diferentes fotogramas para obtener datos de alto rendimiento de la formación de condensado EWS-FLI1.
>2. Análisis de intensidad para mCherry-EWS-FLI1
- Importe los datos como secuencias de imágenes en el software ImageJ, seleccione los puntos en 25× sitios GGAA en un cuadrado de 8×8 píxeles y guarde la imagen en formato .tif.
- Calcule la intensidad como la suma de la intensidad en el cuadrado de 8×8 píxeles, incluidos todos los puntos, y elimine el fondo restando la intensidad del fondo en un área del mismo tamaño cerca del cuadrado de 8x8 píxeles.