Ensayo de modulación del pH en bicapas lipídicas soportadas para detectar interacciones proteína-fosfoinositida

Resumen

Fuente: Shengjuler, D., et al., PIP-on-a-chip: Un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida. J. Vis. Exp. (2017)

En este video, demostramos las interacciones proteína-fosfoinositida en un patrón microfluídico utilizando el ensayo de modulación de pH, utilizando un colorante fluorescente sensible al pH marcado con el lípido de fosfatidiletanolamina de una bicapa lipídica soportada, llamada plataforma microfluídica. Las modulaciones en el pH después de la unión de proteínas a fosfolípidos causan extinción de fluorescencia.

Protocolo

1. Formación de bicapas lipídicas soportadas (SLB)

1. Transfiera 100 μL de SUV que contienen PI(4,5)P2 a un tubo de microcentrífuga de 0,65 mL. Ajuste el pH de la solución a ~3,2 añadiendo 6,4 μL de ácido clorhídrico 0,2 N.
   nota: Confirme el pH de la solución con un medidor de pH equipado con una micro sonda de pH (ver tabla de materiales).
2. Pipetear 10 μL de la solución SUV de pH ajustado en cada canal a través de la entrada y aplicar presión a través de la pipeta hasta que la solución llegue a la salida. Separe la punta de la pipeta y déjela unida al dispositivo.
3. Repita el paso anterior para cada canal y luego incube el dispositivo durante 10 minutos en RT.
   nota: La inyección de vesículas en los microcanales debe realizarse inmediatamente después del montaje del dispositivo.
4. Corte juegos de tubos de entrada y salida de 60 cm (tubo de entrada) y 8 cm (tubo de salida) de largo, respectivamente.
   nota: Cortar el tubo en diagonal y crear un borde afilado facilita la inserción del tubo en las entradas y salidas. El tubo de salida debe tener forma de arco. La longitud del tubo de entrada puede variar según la configuración del microscopio. El diámetro interno del tubo es de 0,05 cm.
5. Con unas pinzas, conecte el juego de tubos de salida al dispositivo y, a continuación, pegue el dispositivo con cinta adhesiva a una platina de microscopio.
6. Sumerja un extremo del juego de tubos de entrada en 25 ml de tampón de funcionamiento contenido en un tubo cónico y péguelo con cinta adhesiva para asegurarse de que el tubo esté asegurado.
7. Coloque el tubo cónico en un terreno más alto (~ 20 cm) que el dispositivo para empujar la solución a través de los microcanales a través del flujo de gravedad; se puede usar un gato de laboratorio para lograr esto.
8. Para cada tubo de entrada, use una jeringa para extraer 1 mL de tampón de corriente del extremo libre del tubo. Retire la punta de la pipeta de la entrada e inserte el extremo libre del tubo de entrada en el dispositivo.
   nota: Introduzca una gota de tampón de funcionamiento en la entrada para reducir la probabilidad de que se introduzca una burbuja de aire en el canal durante este paso. Después de conectar el tubo de entrada al dispositivo, use una toallita sin pelusa para eliminar el exceso de tampón.
9. Repita el paso anterior para conectar todas las piezas del tubo de entrada al dispositivo.
   nota: El flujo de tampón de rodadura a través de los canales ayuda a eliminar el exceso de vesículas y a equilibrar la bicapa a las condiciones experimentales.
10. Abra el software de control del microscopio (consulte la tabla de materiales). En el panel de la izquierda, haga clic en la pestaña "Microscopio" y elija el objetivo "10X".
11. Haga clic en los iconos de imagen "En vivo" y luego en "Alexa 568" en la barra de herramientas. Con las perillas de ajuste fino y de curso, concéntrese en los microcanales.
12. Escanee el dispositivo para comprobar la calidad de los SLB y los canales (Figura 1). A continuación, haga clic en el icono de la imagen "FL Shutter Closed" en la barra de herramientas.
13. Haz clic en la pestaña "Adquisición" y en "Ajustes básicos" selecciona "Tiempo de exposición". Establece el tiempo de exposición en "200 ms".
14. En el panel de la izquierda, haga clic en "Adquisición multidimensional" y en el menú de filtros seleccione el canal rojo (marcado como "Alexa 568"). Luego, haga clic en el menú "lapso de tiempo", establezca el intervalo de tiempo en 5 minutos, la duración en 30 minutos y haga clic en "Inicio".
    nota: En función de la duración (30 min) y el caudal (~1,0 μL/min), se utilizan 30 μL de tampón de funcionamiento para equilibrar el SLB dentro de un canal, es decir, se utilizan 240 μL de tampón de funcionamiento para los 8 canales.
15. Selecciona la herramienta "Círculo" en la pestaña "Medir" y dibuja un círculo en cualquier canal. Haga clic con el botón derecho mientras el círculo está seleccionado y elija "Propiedades". En la pestaña "Perfil", marque "todas las T" para ver la intensidad de fluorescencia en función del tiempo.
    1. Asegúrese de que esta curva alcance una meseta, que indica equilibrio, antes de continuar con el siguiente paso.
16. Baje la solución tampón a una tierra igual a la del dispositivo para detener el flujo.
17. Guarde el archivo de lapso de tiempo.

>2. Probando la interacción del dominio PH de PLC-δ1 con SLBs que contienen PI(4,5)P2

1. Prepare diluciones del dominio PH utilizando el tampón en funcionamiento como diluyente.
   nota: Dado que hay ocho canales dentro del dispositivo, use al menos dos de ellos para controles en blanco. Elija los extremos más alejados de cada lado y use los canales restantes para diluciones de proteínas. Se probaron las siguientes concentraciones de dominio de PH: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 y 2,50 μM. Aproximadamente 200 μL de cada dilución fueron suficientes para alcanzar el equilibrio en 30 min.
2. Uno a la vez, separe cada tubo de salida y aplique 200 μL de cada dilución de proteína en el canal de salida con una pipeta. No apliques ninguna presión, deja que la gravedad haga el trabajo. Separe la punta de la pipeta y déjela unida al dispositivo microfluídico.
3. Repita el paso anterior para cada canal y asegúrese de que no se introduzcan burbujas de aire en los canales durante este proceso.
4. Baje el tubo de entrada a una tierra debajo del dispositivo microfluídico para comenzar a hacer fluir la proteína a través de los microcanales. Pega con cinta adhesiva el extremo libre del tubo a un contenedor de residuos. Fluya las diluciones de proteína durante 30 min.
   nota: Esto invertirá el flujo y permitirá que la proteína se introduzca en los canales. El tiempo de equilibrio y el volumen de diluciones de proteínas necesarias dependerán de la afinidad de la interacción.
5. En el panel izquierdo del software, en la pestaña "Lapso de tiempo", haga clic en "Inicio" para comenzar a tomar imágenes nuevamente.
6. Una vez finalizado el experimento, guarde el archivo de lapso de tiempo.

Resultados

Figura 1: Evaluación de la integridad de los SLB y los microcanales. (A) Una imagen que ilustre SLB y microcanales de alta calidad. B) Fusión incompleta. (C) Microcanales fusionados. (D) Partícula de polvo atrapada dentro de un microcanal. (E) Burbujas de aire atrapadas dentro de los microcanales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Lípidos polares de Avanti	850457C	POPC
L-α-fosfatidilinositol-4-fosfato	Lípidos polares de Avanti	840045X	PI4P
L-α-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato	Lípidos polares de Avanti	840046X	PI(4,5)P2
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina	Lípidos polares de Avanti	850757C	papa; Necesario para la síntesis de oSRB-POPE
Cloruro de lisamina rodamina B sulfonilo (isómeros mixtos)	ThermoFisher Scientific	L-20	Necesario para la síntesis de oSRB-POPE
Sonda lipídica fluorescente sensible al pH (oSRB-POPE)	interno	N/A	Síntesis interna (Huang D. et al. 2013)
Microscopio de epifluorescencia Axiovert 200M	Microscopía Carl Zeiss	N/A	microscopio
Cámara AxioCam MRm	Microscopía Carl Zeiss	N/A	cámara
X-Cite 120	Tecnologías Excelitas	N/A	Fuente de luz
Juego de filtros Alexa 568	Microscopía Carl Zeiss	N/A	Ex/EM 576/603 nm
Software AxioVision LE64 v.4.9.1.0	Microscopía Carl Zeiss	N/A	Software de procesamiento de imágenes
Consejos	VWR	10034-132	Puntas de pipeta de 200 uL; Punta fina y lisa para aplicar la solución proteica en el canal microfluídico
Consejos	VWR	53509-070	Puntas de pipeta de 10 uL; Punta fina y lisa para aplicar la solución de vesícula en el canal microfluídico
Medidor de pH Orion Star A321	Termo Científico	STARA3210	Medidor de pH
Micro sonda de pH Orion	Termo Científico	8220BNWP	micro sonda de pH
N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico)	VWR	VWRB30487	HEPES, Ácido Libre
cloruro de sodio	VWR	BDH8014-2.5KGR	NaCl
tubería	Alambre y cable aliados	TFT-200-24 N	Diámetro interno: 0,020-0,026 pulgadas (0,051-0,066 cm); Espesor de la pared: 0,010 pulgadas (0,025 cm); Tubo flexible de pared delgada de politetrafluoroetileno; Color natural
Gas nitrógeno - Industrial	Praxair	N/A	Proveedor local
Oxígeno Gas - Industrial	Praxair	N/A	Proveedor local
nitrógeno líquido	Praxair	N/A	Proveedor local