1. Configuración del reactivo y la solución
- Para preparar DMEM completo, agregue 5 mL de L-glutamina 200 mM, 5 mL de penicilina-estreptomicina 100x y 50 mL de suero fetal bovino (FBS, concentración final de 10% vol/vol) a 440 mL de DMEM.
nota: Esta solución puede almacenarse a 4 °C durante 1 mes.
- Preparar la solución de agarosa disolviendo 150 mg de agarosa poco gelificante en 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 85 °C para obtener una solución al 1,5% (p/v). Esterilizar por filtración con un filtro de 0,22 μm. Prepare 1 mL de alícuotas de solución de agarosa en 1,5 N
- Preparar el medio del biorreactor.
- Disuelva 13,4 g de polvo de DMEM en 1 L de H2O. ultrapuro
nota: Dependiendo de la aplicación, el volumen final requerido puede diferir (por ejemplo, para un medio de 500 mL, disuelva 6,7 g de polvo en 500 mL H2O).
- Agregue 2% de FBS, 10 mM de NaHCO3, 1x penicilina-estreptomicina (100x) y 2% de D2O (p. ej., para un medio de 500 mL, agregue 10 mL de FBS, 0,4 g de NaHCO3, 5 mL de penicilina-estreptomicina 100x y 10 mL de D2O).
- Mida el pH con un medidor de pH y, si es necesario, ajústelo a 7.4 agregando HCl.
nota: Normalmente, el pH inicial está muy cerca de 7,4.
- Filtre el medio del biorreactor con un filtro estéril accionado por vacío en una botella de vidrio estéril de 250 ml o 500 ml.
- En la campana de flujo laminar, selle la botella con un cabezal de acero estéril con dos boquillas de manguera y conéctelas a un tubo FEP (diámetro exterior = 1/8", diámetro interno = 1,6 mm) que se conectará a la bomba y a un filtro de jeringa de PTFE de 0,22 μm para la entrada de aire.
2. Configuración del biorreactor
- Ensamble la unidad de flujo utilizando un segundo tubo de RMN de la unidad de flujo, que luego será reemplazado por el que contiene las celdas. Consulte las instrucciones de funcionamiento de la unidad de flujo para conocer el montaje correcto.
nota: En este punto, la unidad de flujo ya debe estar limpia (si no, realice el paso 4.2).
- Ajuste el baño de agua conectado al control de temperatura de la unidad de flujo a 37 °C. Coloque la botella del depósito en el baño de agua.
- Conecte el tubo FEP de la botella del depósito a la bomba.
- Gire la válvula del biorreactor a "bypass" y llene previamente la bomba con un medio.
- Gire la válvula del biorreactor a "flujo" y llene previamente el biorreactor con el medio a 0,1 mL/min.
>3. Preparación de la muestra de células
- Recoja las células de la incubadora de CO2.
- Tome un matraz T75 de células HEK293T transfectadas de la incubadora deCO2 y retire el medio gastado.
- Lave las celdas dos veces con 7 ml (cada una) de PBS a temperatura ambiente (~20 °C).
- Use 2 mL de tripsina/EDTA para separar las células. Después de agregar la solución, incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente para separar las células><.
nota: Las células transfectadas pueden tardar un poco más en desprenderse. Si es necesario, incubar las células a 37 °C.
- Inactive la tripsina con 20 mL de DMEM completo; resuspenda completamente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y transfiriéndolas en un tubo de centrífuga de 50 mL.
- Centrifugar las células a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
- Lave las celdas con 10 mL de PBS a temperatura ambiente para eliminar el medio residual.
- Centrifugar las células a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
- Transfiera el pellet de la celda a un tubo de microcentrífuga con tapa de 1,5 mL.
- Incrustar celdas en hilos de agarosa.
- Derretir una alícuota de agarosa solidificada a 85 °C en un baño de agua y posteriormente mantenerla en solución a 37 °C en un calentador de bloque.
- Con una pipeta Pasteur, llene el fondo del tubo de RMN de la unidad de flujo con 60-70 μL de gel de agarosa al 1,5% y colóquelo en hielo. Esto creará un tapón inferior de ~5 mm de altura que permite colocar la muestra de celda dentro del volumen activo de la bobina de RMN de 1H.
- Calentar el pellet de las células obtenido en el paso 3.1.8 a 37 °C durante 15-20 s en el termobloque.
- Vuelva a suspender las células en 450 μL de solución de agarosa. Tenga cuidado de evitar la formación de burbujas.
- Aspire la suspensión de célula y agarosa en un tubo de cromatografía PEEK de ~30 cm de largo (diámetro interno = 0,75 mm) conectado a una jeringa de 1 ml.
nota: Antes de la aspiración, el tubo y el volumen muerto de la jeringa deben llenarse previamente con PBS a temperatura ambiente para evitar la formación de burbujas. La longitud del tubo no es crítica.
- Deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente durante 2 minutos.
- Llene previamente el tubo de RMN de la unidad de flujo con 100 μL de PBS a temperatura ambiente.
- Coloque las roscas de las células incrustadas en agarosa en el tubo de RMN de la unidad de flujo empujando suavemente la jeringa.
nota: Para llenar el tubo de RMN de manera homogénea, comience colocando el extremo del tubo de PEEK en la parte inferior del tubo de RMN y proceda hacia la parte superior mientras se balancea lentamente de izquierda a derecha.
- Repita los pasos 3.2.5, 3.2.6 y 3.2.8 hasta que se haya fundido toda la suspensión de agarosa celular.
- Inserte las células en el biorreactor.
- Retire el tubo de RMN vacío de la unidad de flujo y aumente el caudal a 2 mL/min durante unos minutos para eliminar las burbujas de gas residuales en el tubo de entrada.
- Ajuste el caudal a 0,2 mL/min e inserte el tubo de RMN que contiene las células empujándolo hacia arriba de forma lenta pero constante.
nota: El flujo activo del medio evita el reflujo del contenido del tubo a través de la entrada que de otro modo ocurriría durante la inserción.
>4. Operación y limpieza del biorreactor
- Operación del biorreactor durante el experimento de RMN.
- Ajuste la temperatura en el espectrómetro de RMN a 310 K.
- Inserte la unidad de flujo en el espectrómetro.
- Suministre el medio del biorreactor a un caudal de 0,1 mL/min durante toda la duración de los experimentos de RMN en célula.
- En el momento deseado durante el experimento, inyecte una solución concentrada de la molécula externa en el frasco de depósito medio perforando el tubo de silicona con una jeringa estéril de aguja larga.
nota: La concentración final de la molécula en el medio debe elegirse sobre la base de los conocimientos previos sobre la toxicidad celular y, si se dispone de ellos, de la tasa de difusión predicha/estimada a través de la membrana celular.
- Al final del experimento de RMN, reemplace el tubo que contiene las células con un tubo vacío y enjuague la unidad de flujo con agua.
- Limpieza in situ del biorreactor.
- Limpie la unidad de flujo haciendo fluir las siguientes soluciones a 1 mL/min: hidróxido de sodio (NaOH) 0,2 M; ácido cítrico 3 M; NaOH 0,2 M, durante al menos 30 min cada una, seguido de agua ultrapura filtrada estéril durante >2 h.
- Limpie y autoclave la botella del depósito y el conjunto de tubería después de cada ejecución.
5. Experimentos de RMN
- Configuración de los experimentos de RMN.
nota: Realice estos pasos de antemano, antes de la preparación de la muestra de RMN en la célula, para evitar retrasos entre la recolección de células y la adquisición de datos.
- Cree un nuevo conjunto de datos en el espectrómetro de RMN y establezca los parámetros para los experimentos de RMN deseados.
- Establezca los parámetros para experimentos de RMN 1D 1H.
- Centre la frecuencia portadora de 1H a 4,7 ppm en la señal de agua.
- Seleccione el programa de pulso zgesgp, establezca el ancho espectral en 20 ppm y un pulso cuadrado de 1.000 μs y 180° para la supresión de agua. Establezca un retardo entre exploraciones de 1 s. Adquiere el espectro con 32 escaneos.
- Para celdas que expresan CA II no marcado: seleccione el programa de pulso p3919gp, ajuste el ancho espectral a 30 ppm para cubrir la región imino del espectro y ajuste el retardo para la supresión de agua binomial de modo que la excitación máxima se centre en los cambios químicos de las señales de interés (d7 = 20 μs a 950 MHz). Establezca un retardo entre exploraciones de ≥1 s. Adquirir con 512 escaneos.
- Para celdas que expresan 15 SOD1 marcados con 15N: seleccione el programa de pulsos sfhmqf3gpph, ajuste los anchos espectrales de 1H y 15N a 16 y 50 ppm, respectivamente, el desplazamiento de pulso con forma y el ancho de banda de excitación a 8,5 y 6 ppm, respectivamente, y un pulso de 350 μs para el esquema de desacoplamiento (garp4 u otro según el instrumento). Establezca un retardo entre exploraciones de 0,3 s. Adquiera 16 escaneos y 128 incrementos en la dimensión 15N.
- Adquisición de espectros de RMN en tiempo real.
- Una vez que el biorreactor esté insertado en el espectrómetro de RMN, espere unos minutos para permitir el intercambio del medio.
nota: Este proceso se monitorea fácilmente desde la aparición de la señal de bloqueo, ya que el PBS se reemplaza por un medio que contiene 2% D2O.
- Ajuste la coincidencia y la sintonización del canal 1H, calce el imán y calcule la longitud del pulso duro de 1H 90°.
- Ajuste los niveles de potencia de 1H en cada secuencia de pulso de acuerdo con el pulso duro de 1H.
- Registre un primer espectro zgesgp 1H para comprobar el contenido de la muestra y la homogeneidad del campo.
- Copie los experimentos zgesgp y p3919gp/sfhmqcf3gpph en el número deseado y colóquelos en la cola de adquisición.
Ca: Los espectros zgesgp solo se utilizan para controlar el estado de la muestra y la homogeneidad del campo; por lo tanto, se pueden omitir o registrar con menos frecuencia.
- Para celdas que expresan CA II sin etiquetar: procese los espectros p3919gp aplicando la función de ventana de relleno de cero y ampliación de línea exponencial (LB = 20 Hz).
- Para las celdas que expresan 15SOD1 marcado con N: procese los espectros sfhmqcf3gpph aplicando el relleno de cero y la función de ventana sinusoidal cuadrada (SSB = 2) en ambas dimensiones.
nota: El tamaño de los espectros procesados se puede reducir aún más eliminando las regiones libres de señales (en Topspin, esto se hace estableciendo los valores deseados de STSR y STSI).
