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NOTA: Los siguientes son los pasos para el cribado de fagos T7 que reconocen fármacos utilizando un biosensor QCM y la recuperación de los fagos cribados a través de la infección por E. coli (BLT5615). Los protocolos para la síntesis de un derivado de una molécula pequeña que forma una monocapa autoensamblada (SAM) y para la construcción de la biblioteca de péptidos aleatorios de 15 meros mostrada por el fago T7 se pueden encontrar en otros lugares.
1. Preparación del chip del sensor QCM
- Conecte un chip sensor cerámico en el oscilador de un aparato QCM de 27 MHz y registre la frecuencia intrínseca (Hz) en la fase aérea antes de la inmovilización de moléculas pequeñas.
- Separe el chip y deje caer 20 μL de una solución (1 mM en etanol al 70%) de un derivado de molécula pequeña que forma SAM en el electrodo de oro del chip sensor usando una pipeta.
cautela: El cristal del chip sensor donde se encuentra el electrodo de oro (Au, 0,1 mm de grosor, 2,5 mm de diámetro interior, 4,9 mm2) es extremadamente delgado y puede agrietarse fácilmente (SiO2, 0,06 mm de grosor, 9 mm de diámetro interior). Por lo tanto, pipetee con cuidado.
- Dejar actuar durante 1 h a temperatura ambiente (alrededor de 20 °C) en una placa de Petri con pañuelo humedecido y protegido de las luces de la habitación.
- Lave suavemente la superficie del electrodo con agua ultrapura; luego, elimine las gotas de agua soplando aire con una jeringa o un plumero de aire.
- Configure el chip sensor para el aparato QCM y registre la reducción de la frecuencia en la fase aérea para medir la cantidad de la pequeña molécula que se ha inmovilizado.
nota: Al menos 100 Hz de frecuencia intrínseca son necesarios para una inmovilización exitosa de moléculas pequeñas (1 Hz inmoviliza 30 pg).
>2. Biopaneo de la biblioteca de fagos T7 utilizando un biosensor QCM (Figura 1)
- Coloque una cubeta con un agitador magnético dedicado en el biosensor QCM y vierta 8 mL del tampón de reacción (10 mM de Tris-HCl, 200 mM de NaCl, pH 7-8) en la cubeta.
- Conecte el chip del sensor QCM al oscilador y tire hacia abajo del brazo del oscilador para sumergir el chip en el búfer que se agita a 1000 rpm.
- Comience a monitorear la frecuencia QCM en la computadora personal (PC) y espere hasta que el sensorgrama se equilibre a alrededor de 3 Hz/min de la deriva de frecuencia.
- Inyecte 8 μL de una biblioteca de fagos T7 (1-2 ×10 10 pfu/mL) en la cubeta (concentración final: 1-2 × 107 pfu/mL) y marque el punto de inyección en el sensor.
- Monitorizar la reducción de frecuencia causada por la unión de los fagos T7 a la pequeña molécula inmovilizada en la superficie del electrodo de oro durante 10 min.
- Detenga el monitor de frecuencia QCM, desaloje el chip del sensor del oscilador y elimine el tampón soplando aire y/o absorbiendo con toallitas.
- Coloque el chip sensor en una placa de Petri húmeda y deje caer los 20 μL de la suspensión de E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5-1,0 después de agitar a 37 °C agregando IPTG a 1 mM) células huésped en la fase logarítmica sobre el electrodo de oro.
- Cierra la tapa del plato y cúbrelo con papel de aluminio para bloquear la luz.
- Incubar la placa a 37 °C durante 30 min en un mezclador de microplacas de 96 pocillos (1000-1500 rpm) para mejorar la recuperación de los fagos T7 unidos.
- Recupere los 20 μL de la solución y suspenda en 200 μL de medio LB.
nota: Las muestras obtenidas en esta etapa se pueden conservar a 4 °C durante una semana.
- Prepare una serie de diluciones de la solución de fagos para el aislamiento de la placa y la secuenciación del ADN de acuerdo con el procedimiento general descrito en las instrucciones del fabricante.
