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1. Preparación del sistema
- Conecte los detectores MALS y dRI aguas abajo del detector UV del FPLC. Evite los detectores de pH y conductividad, ya que agregarán un volumen significativo entre detectores entre los detectores UV y MALS. Utilice un tubo capilar de 0,25 mm de diámetro interno desde la columna hasta y entre los detectores, y un tubo capilar de 0,75 mm de diámetro interno en la salida de los detectores al colector de residuos o fracciones.
- Asegúrese de que se hayan establecido las conexiones de señal necesarias entre el FPLC y los detectores, incluida la salida analógica del detector UV a la entrada analógica MALS y la salida digital del FPLC al MALS Autoinject, a través de la caja de E/S del FPLC.
- Instale una columna SEC analítica adecuada que cubra un rango de fraccionamiento de al menos 20 kDa a 500 kDa. Compruebe la información del producto para determinar si la columna es adecuada para el rango de MW, pH y otras propiedades de la muestra y la fase móvil.
>2. Preparación del búfer, vaciado del sistema durante la noche y comprobación de la limpieza
- Utilizando reactivos de grado HPLC, prepare 1 L de solución salina tamponada con fosfato con 50-100 mM de NaCl. Filtre el tampón a 0,1 μm utilizando un filtro de poliéter sulfona con tapa de botella o similar. Filtre los primeros 50-100 mL de tampón a una botella de desecho y deséchelo, para eliminar las partículas de los filtros secos, y luego filtre el resto a una botella limpia y estéril que haya sido lavada a fondo con agua filtrada y desionizada y tapada para evitar la entrada de polvo><.
nota: Pueden utilizarse otros disolventes de fase móvil, como un tampón Tris, si se van a analizar proteínas adicionales que se disuelven preferentemente en dichos disolventes.
- Enjuague durante la noche a un caudal de 0,5 mL/min, o según lo recomiende el fabricante de la columna, para equilibrar la columna en el tampón y eliminar las partículas. Utilice el modo de flujo continuo de FPLC y asegúrese de que el flujo no se detenga hasta que se completen todas las ejecuciones de SEC-MALS.
- Coloque la celda de flujo dRI en modo de purga durante el lavado durante la noche. Desactive la purga antes de comenzar las ejecuciones de muestras.
- Al comenzar el lavado, aumente gradualmente el caudal para evitar el efecto de "desprendimiento de columna" (o liberación de partículas) causado por un cambio repentino de presión en la columna.
- Si se sabe que el sistema es bastante estable y libre de partículas, y en equilibrio con la fase móvil deseada, reemplace el lavado nocturno por uno más corto, de 2-3 h.
- Compruebe la limpieza del sistema golpeando ligeramente el tubo aguas abajo de la columna para liberar las partículas acumuladas y observando la señal en el detector de 90° en la pantalla del panel frontal del instrumento MALS. Verifique que el ruido de pico a pico no sea superior a 50 -100 μV.
- Realice una inyección "en blanco" para verificar que el inyector esté limpio de partículas. Un "blanco" es simplemente el tampón circulante, preparado en un vial nuevo y estéril.
- Si el pico de partículas no tiene más de 1 mL de volumen y no más de 5 mV por encima de la línea de base, entonces el sistema está listo para las muestras. De lo contrario, realice inyecciones adicionales en blanco hasta que esté limpio o realice el mantenimiento para limpiar el inyector.
>3. Preparación y carga de la muestra
- Prepare al menos 200 μL de BSA a 1-2 mg/mL en el tampón SEC.
nota: Para evitar la precipitación, el BSA nunca debe disolverse en agua pura.
- Filtre la proteína a 0,02 μm con un filtro de punta de jeringa.
- Deseche las primeras gotas de filtrado para eliminar las partículas de los filtros secos.
- Alternativamente, centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 15 minutos para permitir la precipitación de agregados no solubles y otras partículas grandes.
- Inyecte 100 μL de la solución BSA en el bucle.
nota: Esta es la cantidad recomendada de material, y se puede inyectar en mayor o menor medida según las circunstancias de la muestra, como la estabilidad o la disponibilidad. La cantidad de proteína requerida por inyección varía inversamente con el peso molecular: se necesita el doble de masa de proteína si el peso molecular es de 33 kDa o la mitad del de BSA.
>4. Preparación del software MALS
- Abrir nuevo | Experimente desde Método en el menú de software MALS y seleccione el Método en línea en la carpeta Métodos del sistema de dispersión de luz. Si hay un detector DLS, seleccione el método en línea de la sección Dispersión de luz | Con carpeta QELS.
- En la sección Configuración, establezca los parámetros de la fase de muestra y móvil.
- En la vista Bomba genérica, establezca el caudal en el utilizado en la FPLC.
- En la vista Bomba genérica, rama Solvente, campo Nombre, seleccione PBS.
- En la vista Inyector, rama de muestra, introduzca el nombre como BSA y establezca dn/dc = 0,185 (el valor estándar para proteínas no modificadas), A2 = 0 y coeficiente de extinción UV = 0,667 mL/(mg-cm).
nota: Para otras proteínas, el coeficiente de extinción UV280 nm se puede encontrar en la literatura o calcularse a partir de su secuencia utilizando varias herramientas de software de dominio público.
- En la sección Procedimientos, vista Recolección básica, seleccione la casilla de verificación Activador en autoinyección y establezca la duración de la ejecución en 70 minutos para que se recopilen datos para toda la elución hasta que se alcance el volumen total de permeación de la columna SEC.
nota: La cantidad de tiempo necesaria puede variar con la columna y el caudal: se requieren 35 minutos de recolección para una columna HPLC-SEC estándar de 7,8 mm x 300 mm a 0,5 mL/min.
- Inicie el experimento en el software MALS haciendo clic en el botón Ejecutar. Comenzará a leer los datos después de recibir la señal de pulso del instrumento FPLC a través del detector MALS.
- Ponga a cero la señal dRI haciendo clic en el botón Puesta a cero automática en el panel frontal del instrumento.
>5. Preparación del software FPLC
- Inserte el nombre de la proteína y la ejecución en el software FPLC, en Manual | Ejecutar instrucciones manuales | Marca de ajuste.
- Cambie la válvula de inyección de Carga manual a Inyectar bajo la ruta de flujo | Válvula de inyección.
- Incluya una señal de pulso insertando un pulso de 0,5 s debajo de la caja de E/S | Salida digital de pulsos. Esto desencadenará la recopilación de datos en el software MALS.
6. Inyecta la muestra en el bucle. Haga clic en Ejecutar en el software FPLC para iniciar la ejecución del experimento.