Purificación de afinidad de complementación bimolecular para aislar dos proteínas que interactúan

Abstract

Fuente: Hastings, J. F. et al. Disección de complejos de señalización multiproteica mediante purificación de afinidad de complementación bimolecular (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

En este vídeo, hemos demostrado la purificación de afinidad por complementación bimolecular, BiCAP, para detectar y aislar dímeros de proteínas específicas utilizando anticuerpos de dominio único específicos de conformación.

Protocol

1. Cultivo celular y transfección

NOTA: Para la transfección de los vectores BiFC es importante lograr una transfección de alta eficiencia y relativamente homogénea. Es probable que los vectores sean compatibles con cualquier reactivo de transfección estándar, y las condiciones de transfección deben optimizarse en consecuencia. Para realizar la espectrometría de masas, generalmente cultivamos células dentro de placas de 10 cm, aunque esto también se puede reducir proporcionalmente a placas o placas más pequeñas para experimentos que requieren menos material.

1. Siembre 1,0 × 10⁶ células ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11995-073	cultivo celular
FBS	Tecnologías de la Vida Australia	10099-141	cultivo celular
Penicilina/Estreptomicina	Tecnologías de la Vida Australia	15070-063	cultivo celular
Tampón de transfección jetPRIME	Polyplus	Págs. 114-15	cultivo celular
reactivo de transfección jetPRIME	Polyplus	Págs. 114-15	cultivo celular
PhosSTOP (inhibidor de la fosfatasa)	Sigma-Aldrich	4906837001	cultivo celular
Cóctel completo de inhibidores de la proteasa sin EDTA	Roche	11873580001	Artículos de plástico
Raspador de células	Sarstedt	83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek Gmbh	GTA-100	Nanobody GFP acoplado a perlas de agarosa
Anticuerpo monoclonal GFP N-terminal	Covance	MMS-118P	Detectará la etiqueta V1 dentro de los vectores BiFC
Anticuerpo monoclonal GFP C-terminal	Roche	11814460001	Detectará la etiqueta V2 dentro de los vectores BiFC
Tampón de muestra	Invitrogen	NP0008	Suplementado con 1 mL de β-mercaptoetanol.
Tripsina modificada de grado de secuenciación	Corporación Promega	V5117h	cultivo celular
Tubos de microcentrífuga LoBind	Diagnóstico en el punto de atención	0030 108 116	Artículos de plástico
Yodoacetamida	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Preparado a 5 mg/mL en agua ultrapura
LTQ Orbitrap Velos Pro	Termo Fisher
Células DH5α	Termo Fisher		Células competentes para choques térmicos