Purificación de afinidad de complementación bimolecular para aislar dos proteínas que interactúan

Resumen

Fuente: Hastings, J. F. et al. Disección de complejos de señalización multiproteica mediante purificación de afinidad de complementación bimolecular (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

En este vídeo, hemos demostrado la purificación de afinidad por complementación bimolecular, BiCAP, para detectar y aislar dímeros de proteínas específicas utilizando anticuerpos de dominio único específicos de conformación.

Protocolo

1. Cultivo celular y transfección

NOTA: Para la transfección de los vectores BiFC es importante lograr una transfección de alta eficiencia y relativamente homogénea. Es probable que los vectores sean compatibles con cualquier reactivo de transfección estándar, y las condiciones de transfección deben optimizarse en consecuencia. Para realizar la espectrometría de masas, generalmente cultivamos células dentro de placas de 10 cm, aunque esto también se puede reducir proporcionalmente a placas o placas más pequeñas para experimentos que requieren menos material.

1. Siembre 1,0 × 10⁶ células HEK293T en un plato de 10 cm con 10 mL de medio DMEM, suplementado con 10% de FBS y penicilina/estreptomicina (1:100).
2. Diluir 2,5 μg de cada vector BiFC en 500 μL de tampón de transfección (ver Tabla de Materiales) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Añadir 10 μL de reactivo de transfección (ver Tabla de Materiales).
4. Mezcla de vórtice durante 10 s, luego centrifugar brevemente. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
5. Agregue la mezcla de transfección de ADN al plato, gota a gota. Incubar las células durante un período de tiempo suficiente para que las proteínas de fusión BiFC interactúen y para el plegamiento de Venus y la maduración de fluoróforos, generalmente ~ 8 - 24 h.
   NOTA: El pico de excitación de Venus es de 515 nm, y su emisión máxima es de 528 nm, aunque esto se ve fácilmente utilizando un microscopio fluorescente estándar configurado para visualizar la fluorescencia GFP.

>2. Preparación de la muestra

1. Recolección de lisados
   1. Antes de la recolección del lisado, prepare el tampón de lisis celular [50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% (v/v) de detergente no iónico (ver Tabla de materiales)]. Conservar a 4 °C.
   2. Inmediatamente antes de la cosecha, complemente 10 mL de tampón de lisis celular con un inhibidor de la proteasa y un inhibidor de la fosfatasa (consulte la tabla de materiales). Mantenga el tampón de lisis celular suplementado en hielo.
   3. Lave las celdas dos veces en PBS helado. Aspire el PBS y agregue 1 ml de tampón de lisis celular suplementado con hielo frío. Coloque el plato sobre hielo, asegurándose de que el tampón se extienda por toda la superficie.
   4. Incube en hielo durante aproximadamente 5 minutos, luego use un raspador de células (consulte la Tabla de materiales) para raspar las células y transferirlas a un tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml.
   5. Eliminar los restos celulares centrifugando el lisado recogido a 18.000 × g durante 5 min a 4 °C y transferir el sobrenadante aclarado a tubos de microcentrífuga frescos.
      nota: En este punto, el lisado se puede utilizar inmediatamente o almacenar a -80 °C. También se recomienda mantener una alícuota de lisado crudo para poder validar la eficiencia de la transfección y la purificación por afinidad.
2. Purificación por afinidad
   nota: El paso de aislamiento de BiCAP se realiza utilizando el nanocuerpo GFP conjugado con perlas de agarosa (ver Tabla de Materiales).
   1. Prepare las perlas de agarosa lavando un volumen adecuado (20 μL por muestra + 10 μL de exceso) en 1 mL de PBS. Centrifugar las perlas a 300 x g y eliminar el sobrenadante.
   2. Añadir 20 μL a cada muestra de lisado.
   3. Incubar las muestras durante 2 h a 4 °C con rotación de extremo a extremo.
      nota: En este punto, las muestras se pueden preparar para SDS-PAGE y Western blot, o para el análisis por espectrometría de masas.
3. Preparación de eluyente BiCAP para Western blot.
   1. Centrifugar las perlas a 300 x g y lavarlas tres veces en el tampón de lisis celular.
   2. Vuelva a suspender las perlas lavadas en 50 μL de tampón de muestra adecuadamente diluido (consulte la Tabla de materiales) y caliente las muestras a 95 °C durante 2-3 min.
      nota: Las muestras preparadas de esta manera pueden almacenarse a -20 °C durante varios meses.
   3. Realice SDS-PAGE y Western blot para las etiquetas V1 y V2 (consulte la Tabla de materiales), así como para cualquier otra proteína de interés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Gibco	11995-073	cultivo celular
FBS	Tecnologías de la Vida Australia	10099-141	cultivo celular
Penicilina/Estreptomicina	Tecnologías de la Vida Australia	15070-063	cultivo celular
Tampón de transfección jetPRIME	Polyplus	Págs. 114-15	cultivo celular
reactivo de transfección jetPRIME	Polyplus	Págs. 114-15	cultivo celular
PhosSTOP (inhibidor de la fosfatasa)	Sigma-Aldrich	4906837001	cultivo celular
Cóctel completo de inhibidores de la proteasa sin EDTA	Roche	11873580001	Artículos de plástico
Raspador de células	Sarstedt	83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek Gmbh	GTA-100	Nanobody GFP acoplado a perlas de agarosa
Anticuerpo monoclonal GFP N-terminal	Covance	MMS-118P	Detectará la etiqueta V1 dentro de los vectores BiFC
Anticuerpo monoclonal GFP C-terminal	Roche	11814460001	Detectará la etiqueta V2 dentro de los vectores BiFC
Tampón de muestra	Invitrogen	NP0008	Suplementado con 1 mL de β-mercaptoetanol.
Tripsina modificada de grado de secuenciación	Corporación Promega	V5117h	cultivo celular
Tubos de microcentrífuga LoBind	Diagnóstico en el punto de atención	0030 108 116	Artículos de plástico
Yodoacetamida	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Preparado a 5 mg/mL en agua ultrapura
LTQ Orbitrap Velos Pro	Termo Fisher
Células DH5α	Termo Fisher		Células competentes para choques térmicos