>1. Preparación de la muestra
- Purificar la biomolécula deseada.
nota: Este protocolo utiliza el aptámero de ADN de unión a cocaína MN4 comprado después de intercambiarlo tres veces con NaCl 2 M, seguido de tres rondas de agua desionizada utilizando un filtro centrífugo con una membrana de corte de peso molecular de 3 kDa.
- Sintetizar y purificar, o comprar el ligando termolábil deseado.
nota: MN4 se une al ligando termolábil cocaína. MN4 también se une a la quinina, que se utiliza como control negativo para la termolabilidad del ligando a estas temperaturas experimentales.
- Preparar tampones para la diálisis de la biomolécula purificada y la disolución de ligandos (20 mM de fosfato de sodio y 140 mM de tampón de NaCl, pH 7,4, para MN4 y los ligandos utilizados aquí).
- Diálisar la biomolécula contra al menos 2 L del tampón utilizando un tubo de diálisis con corte de 0,5 a 1,0 kDa.
- Filtre el tampón final (denominado tampón de trabajo) a través de un filtro de 0,2 μm que se haya equilibrado completamente con el tampón.
- Pesar las masas deseadas de los ligandos y disolverlas en un tampón de trabajo filtrado. Si las concentraciones de ligando deseadas requieren masas demasiado pequeñas para pesarlas con precisión, haga una solución madre de ligando concentrada (10x, por ejemplo)
nota: Es crucial que todos los experimentos de DSC utilicen el mismo tampón de trabajo para la muestra y el ligando, es decir, nunca realicen un experimento en el que el ligando se disuelva en un lote de tampón de trabajo diferente al de la biomolécula, ya que esto causará artefactos de desajuste de tampón en los datos.
- Filtre la solución madre de biomoléculas a través de un filtro de 0,2 μm que se haya equilibrado completamente con el tampón de trabajo.
- Determine la concentración de biomoléculas mediante mediciones de absorbancia (260 nm para ácidos nucleicos como MN4 y 280 nm para proteínas).
- Almacene la biomolécula y el ligando preparados en un refrigerador a 4 °C (adecuado para MN4 y los ligandos utilizados aquí), o a -20 o -80 °C si la biomolécula y los ligandos toleran la congelación y se requiere almacenamiento a largo plazo. Desgasifique las soluciones tampón, biomolécula y ligando en un desgasificador de mesa (consulte la Tabla de materiales) antes de cargarlo en el DSC.
nota: La desgasificación ayuda a prevenir la formación de burbujas en el DSC a temperaturas más altas. Las burbujas causan artefactos de señal que oscurecen las formas de los picos y las líneas de base de DSC.
>2. Preparación DSC
- Desenrosque la manija de presión del DSC (consulte la tabla de materiales).
- Pase el tubo de silicona desde el tampón de trabajo y conéctelo a la brida frontal (abertura metálica) del capilar de referencia.
- Cree un puente entre los capilares de referencia y de muestra conectando la brida de referencia trasera a la brida de muestra frontal.
- Conecte un trozo de tubo de silicona a la brida de muestra trasera que va a un matraz de residuos con una línea de vacío conectada.
- Encienda la línea de vacío para enjuagar el DSC con 200 ml de tampón de trabajo.
- Cargue el capilar de referencia del DSC con el tampón de trabajo. Fije secciones de aproximadamente 3 a 5 cm de tubo de silicona a las bridas capilares de referencia.
- Inserte una punta de pipeta de 1 ml en el tubo de silicona de la brida trasera. Extraiga 0,8 ml de tampón de trabajo con una pipeta e inserte la punta de la pipeta con tampón en el tubo de silicona de la brida de referencia frontal.
- Presione suavemente el émbolo de la pipeta hacia abajo para pasar el tampón de trabajo a través del tubo de silicona delantero hasta el capilar de referencia y hacia arriba hasta la punta de pipeta adjunta de la brida trasera. Presione hacia abajo el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del tampón de trabajo llegue justo por encima del tubo de silicona delantero, luego suelte el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del tampón de trabajo llegue justo por encima del tubo de silicona trasero.
- Repita pasando el tampón de trabajo de un lado a otro para purgar el volumen en el capilar de referencia de burbujas.
nota: Por lo general, 10 pasadas de la solución de un lado a otro son suficientes para eliminar las burbujas.
- Tape la punta de la pipeta trasera con el pulgar y tire suavemente hacia arriba de la punta de la pipeta trasera y la pipeta delantera para extraerlas de las bridas de referencia con el tubo de silicona colocado.
- Cargue el capilar de muestra con el tampón de trabajo como en los pasos 2.6 - 2.9. Coloque una tapa de plástico negro en las bridas traseras de referencia y muestra, dejando las bridas delanteras al descubierto.
- Coloque la manija de presión.
- Abra el software DSC (ver Tabla de Materiales) y presurice el instrumento haciendo clic en la flecha roja hacia arriba en la parte superior de la interfaz una vez que la lectura de potencia se haya estabilizado; la potencia DSC se indica en un cuadro en la parte superior derecha de la interfaz junto con la lectura de temperatura y presión del instrumento><.
nota: Controle la lectura de energía a medida que el DSC presuriza. Los cambios en la potencia de más de ~ 10 μW indican la formación de burbujas en los capilares, lo que puede causar artefactos en los datos. Las soluciones deben eliminarse y desgasificarse aún más antes de continuar.
- Equilibre el DSC con el búfer de trabajo realizando un escaneo hacia adelante y hacia atrás. En la pestaña "Método experimental" en el lado izquierdo de la pantalla, asegúrese de que la opción "Escaneo" esté seleccionada para ejecutar el DSC en modo de escaneo de temperatura.
nota: Los parámetros experimentales son el rango de escaneo de temperatura, la velocidad de escaneo, el tiempo de equilibrio de baja y alta temperatura y el número de escaneos.
- En el recuadro "Parámetros de temperatura" en la pestaña "Método experimental", haga clic en el botón "Calefacción". Introduzca 1 y 100 °C para las temperaturas experimentales inferior y superior, 1 °C/min para la velocidad de exploración y 60 s para el período de equilibrio.
- Haga clic en el botón "Agregar serie" debajo del campo de entrada para el período de equilibrio. Ingrese 2 en el campo "Pasos para agregar" en la ventana emergente (para un escaneo de calefacción y otro de refrigeración) y marque la casilla "Calefacción / refrigeración alternativa". Haga clic en "Aceptar"; Los escaneos agregados aparecen en la parte inferior de la interfaz. Compruebe que los parámetros de cada escaneo sean los deseados.
- Inicie el experimento haciendo clic en el botón verde "reproducir" en la parte superior de la interfaz. Navegue hasta la carpeta deseada e introduzca un nombre de archivo para guardar el experimento en la ventana emergente. Para ver el progreso del experimento, haga clic en la pestaña "Datos" a la derecha de la pestaña "Método del experimento".
>3. Recopilación de conjuntos de datos DSC de ligandos termolábiles
>NOTA: El procedimiento mínimo consta de cinco experimentos: experimentos de referencia de tampón con y sin ligando (utilizados para la sustracción de referencia), experimentos de muestra con la biomolécula libre, la biomolécula unida al ligando y la biomolécula unida al ligando con un período de equilibrio a alta temperatura más largo.
- Ejecute experimentos de referencia para la sustracción de línea base de los datos de muestra. Vuelva a cargar el DSC con el tampón de trabajo en ambos capilares y recoja múltiples escaneos hacia adelante y hacia atrás en un rango de temperatura adecuado a 1 °C min-1 con un tiempo de equilibrio superior (alta temperatura) de 120 s.
- Elimine los escaneos de equilibrio de búfer anteriores de la parte inferior de la interfaz resaltando cada uno individualmente y haciendo clic en la X roja en el centro derecho de la interfaz. Agregue los nuevos escaneos haciendo clic en el botón "Agregar serie", ingresando 20 en el campo de "Pasos para agregar" y marcando la casilla "Calefacción / Refrigeración alternativa". Haga clic en Aceptar y ejecute el experimento haciendo clic en el botón verde de reproducción como se indica arriba.
- Repita los pasos 3.1 - 3.1.1 con el tampón de trabajo que contiene la concentración deseada de ligando en ambos capilares para obtener los experimentos de referencia para el ligando (recoja dos experimentos separados utilizando tiempos de equilibrio a alta temperatura de 120 s y 600 s respectivamente, para utilizarlos en la adquisición de la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábil).
nota: La velocidad de escaneo utilizada aquí asegura que la biomolécula en experimentos posteriores esté en equilibrio térmico en los escaneos hacia adelante y hacia atrás. Las velocidades de escaneo < 0,1 - 0,2 °C min-1 conducen a termogramas ruidosos y no son aplicables en experimentos de DSC. Las temperaturas deben extenderse desde muy por debajo de la temperatura de fusión de la biomolécula libre hasta muy por encima de la temperatura de fusión de la biomolécula saturada con ligando (~ 20 - 80 °C para MN4). Verifique la reproducibilidad de los exámenes (por ejemplo, 10 exámenes hacia adelante y 10 hacia atrás para un total de 20 son suficientes).
- Si utiliza varios ligandos (como cocaína y quinina), enjuague el DSC con 200 mL de tampón de trabajo (repita desde el paso 2.5) entre corridas para eliminar los ligandos de los capilares y evitar la contaminación cruzada><.
nota: Es útil realizar un experimento de replicación en la biomolécula libre después de una ejecución unida al ligando para verificar si el ligando anterior se adsorbe fuertemente a las paredes capilares y no se elimina adecuadamente con el lavado del tampón. Si los termogramas para la biomolécula libre parecen estar desplazados a una magnitud mayor y a una temperatura de desnaturalización más alta después del experimento unido al ligando, es probable que el ligando anterior todavía esté presente en el calorímetro después del lavado. Retire el ligando adsorbido incubando los capilares con Contrad-70 al 20% durante 1 h a 60 °C con los tapones de plástico y la manija de presión desactivados. En el software DSC, cambie el modo experimental a "Isotérmico" en la pestaña Método experimental. Elija 3.600 s para la duración y 60 °C para la temperatura isotérmica, con cero para el tiempo de equilibrio. Haga clic en "Agregar al método experimental". El experimento isotérmico aparece en la parte inferior de la pantalla. Una vez finalizado, enjuague el instrumento con 2 L de agua desionizada y repita desde el paso 2.5.
- Ejecute experimentos de muestra utilizando el mismo procedimiento de carga de DSC y los mismos parámetros experimentales que los escaneos de referencia. Para el conjunto de datos de biomoléculas libres, asegúrese de que el capilar de referencia contenga el tampón de trabajo, mientras que el capilar de muestra contenga la biomolécula libre a la concentración deseada en el tampón de trabajo.
- Para los experimentos unidos a ligando, asegúrese de que el ligando esté en el tampón de trabajo en el capilar de referencia y que la biomolécula más el ligando esté en el tampón de trabajo en el capilar de muestra. Enjuague el sistema entre adiciones de diferentes ligandos como en el paso 2.5.
- Realice un experimento adicional con la biomolécula unida al ligando termolábil en el que el período de equilibrio a alta temperatura se incremente a 600 s y todos los demás parámetros experimentales sean los mismos que en el paso 3.2.1.
nota: La duración del período de equilibrio a alta temperatura para el segundo experimento unido al ligando se elige simplemente para garantizar que el ligando se agote más rápidamente que el experimento de tiempo de equilibrio corto. Si los picos unidos al ligando del primer experimento decaen lentamente en función del número de exploración (por ejemplo, las diferencias en los máximos de pico sucesivos son ≤ 0,5 °C), estime aumentos de 10 a 20 veces en el período de equilibrio a alta temperatura para agotar adecuadamente el ligando durante el segundo experimento. El cálculo preciso de la constante de velocidad para la conversión de ligandos requiere que el segundo experimento tenga un agotamiento más rápido del ligando en relación con el primero. Las concentraciones de ligandos extraídas del análisis global de los dos experimentos serán similares y, por lo tanto, inutilizables si la depleción del ligando no se acelera lo suficiente en el segundo experimento.
>4. Procesamiento de datos
- Abra los archivos del experimento DSC en el software de análisis de datos DSC (consulte Tabla de materiales) y exporte los datos de potencia brutos como hojas de cálculo.
- Importe las hojas de cálculo que contienen los datos de potencia brutos en el software para el ajuste de datos.
- La línea de base resta los datos de la muestra restando los datos de potencia del tampón de los experimentos de biomoléculas libres y unidas al ligando.
nota: Para el experimento del ligando termolábil, la concentración del ligando inicial disminuye con cada exploración. Por lo tanto, lo ideal es restar el escaneo de búfer 1 del escaneo de muestra 1, y así sucesivamente. Hemos encontrado que las exploraciones de tampón con cocaína no cambian apreciablemente a medida que avanza la conversión del ligando y, por lo tanto, se puede usar una sola exploración de tampón de ligando termolábil para restar todos los datos unidos al ligando termolábil.
- Convierta los datos de potencia de muestra sustraídos desde la línea de base a capacidad calorífica.
nota: La conversión requiere el volumen específico parcial de la biomolécula, que se puede estimar.
>5. Análisis de datos
- Ajuste globalmente el conjunto de datos de capacidad calorífica ligada a ligando termolábil de tiempo de equilibrio corto con un único conjunto de parámetros de referencia, concentración de ligando, plegamiento y unión de ligando.
- Repita el ajuste global para el conjunto de datos de tiempo de equilibrio largo para calcular la constante de velocidad para la conversión de ligandos termolábiles.
