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1. Preparación de CXCL12, tampón de ensayo y células Jurkat para el ensayo de unión a la competencia
- Prepare una solución madre de CXCL12AF647 (20 μg/mL; ver Tabla de Materiales y Reactivos) disolviendo el reactivo liofilizado (almacenado a -80 °C, en la oscuridad) en agua ultrapura suplementada con 0,01% (volumen/volumen) de Polisorbato 20. Almacene las alícuotas de un solo uso de esta solución madre a -80 °C, protegidas de la luz.
- Prepare el tampón de ensayo añadiendo 40 mL de HEPES (1 M, concentración final de 20 mM) a 200 mL de solución salina balanceada de Hank (HBSS, 10x, sin rojo de fenol y sin bicarbonato de sodio, concentración final de 1x). Añadir agua ultrapura para obtener un volumen final de 2 L. Añadir 4 g (0,2% peso/volumen) de albúmina sérica bovina (BSA) y disolver el BSA mediante agitación magnética. Finalmente, ajuste el pH a 7.4 (use NaOH para esto) y filtre la solución a través de poros de 0.2 μm (ver Tabla de Materiales y Reactivos) usando un colector de vacío.
NOTA: Este tampón de ensayo se utilizará en todos los pasos posteriores del protocolo.
- Cuenta el número y la viabilidad de las células Jurkat. Para ello, tome una muestra de la suspensión celular y dilúyala en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
nota: Utilizamos de forma rutinaria un analizador de viabilidad celular automatizado (ver Tabla de Materiales y Reactivos) capaz de contar suspensiones celulares a diferentes concentraciones. Para el recuento de células, diluya 0,5 mL de suspensión celular en 1,5 mL de PBS (también son posibles otras diluciones, por ejemplo, 0,1 mL en 1,9 mL de PBS). Hay otros dispositivos disponibles en el mercado para contar el número de células y la viabilidad que deberían funcionar igual de bien.
- Recoja el número deseado de células (es decir, ~24 x 106 células para ejecutar el ensayo con una placa completa de 96 pocillos) en un tubo estéril de 50 ml por centrifugación (consulte la Tabla de materiales y reactivos para el tipo de centrífuga utilizada) a 400 x g durante 5 minutos en RT.
- Vierta suavemente el sobrenadante sin alterar la pelleta de la célula. Agregue tampón de ensayo nuevo (por ejemplo, 20 ml) y vuelva a suspender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Vuelva a centrifugar las células a 400 x g durante 5 min en RT.
- Vuelva a verter el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en un tampón de ensayo fresco para obtener una densidad de 5 x 106 células/mL.
>2. Ensayo de unión de competencia
NOTA: El ensayo de unión de competencia real se realiza en RT y se puede realizar en condiciones no estériles.
- Diluir los compuestos objeto de investigación en tampón de ensayo (véase 1.2) para obtener la concentración deseada. Prepare una concentración fija de compuesto para el cribado inicial (por ejemplo, una concentración final de 10 μM) o, alternativamente, una serie de concentraciones de dilución en serie para una caracterización más detallada de los compuestos (por ejemplo, una serie de dilución de 1/3, 1/4 o 1/5 a partir de 1 μM, concentración final). Tenga en cuenta que la solución compuesta finalmente se diluirá 2 veces en el ensayo; Por lo tanto, prepare una solución concentrada 2x.
- Dispense 100 μL de solución compuesta (2x concentrada) en una placa inferior redonda transparente de 96 pocillos (consulte la Tabla de materiales y reactivos) de acuerdo con un diseño experimental predefinido (por ejemplo, Figura 1C).
NOTA: En esta etapa, se incluyen en el ensayo muestras de control negativas y positivas. En la muestra de control negativo, se añaden 100 μL de tampón de ensayo en lugar del compuesto a los pocillos de la placa de 96 pocillos. Para la muestra de control positivo, también se agrega un tampón de ensayo durante este paso. Véase también la Figura 1C para un diseño experimental típico en el que se prueba una serie de diluciones de varios compuestos.
- Añada 50 μl de suspensión celular (ver 1.7; 0,25 x 106 celdas) de un depósito de reactivo a la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Incubar la placa durante 15 min en RT en la oscuridad.
- Agregue 50 μL de CXCL12 marcado con fluorescencia (es decir, 100 ng/mL de CXCL12AF647 en tampón de ensayo, 4x concentrado, concentración final de 25 ng/mL) de un depósito de reactivo similar a los pocillos de la placa de 96 pocillos. Incubar durante 30 min en RT en la oscuridad.
nota: Para las muestras de control negativo, agregue tampón de ensayo en su lugar. Por lo tanto, la señal fluorescente detectada en las muestras de control negativas corresponderá a la señal de fondo autofluorescente (Figura 1A). Para las muestras de control positivo, agregue 50 μL/pocillo de CXCL12AF647. Las muestras de control positivo producirán la señal de fluorescencia máxima detectada, ya que no se incluyó ninguna inhibición potencial por preincubación con compuestos (Figura 1A).
- Centrifugar la placa de 96 pocillos a 400 x g durante 5 min en RT. Retire el sobrenadante de las células peletizadas volteando la placa. Seque el plato sobre un pañuelo de papel.
- Añada 200 μl de tampón de ensayo fresco de un depósito de reactivo a los pocillos mediante una pipeta multicanal. Proceda inmediatamente.
- Vuelva a centrifugar la placa durante 5 min a 400 x g a RT. Retire el sobrenadante volteando la placa y séquela nuevamente en un pañuelo de papel.
- Vuelva a suspender suavemente el pellet celular en 200 μL de paraformaldehído al 1% disuelto en PBS. Este paso arreglará las celdas.
- Continuar el protocolo inmediatamente con la cuantificación de la fluorescencia por citometría de flujo.
>3. Análisis de las muestras por citometría de flujo
CXCL12 Las células teñidas y fijadasAF647 ya están listas para ser analizadas mediante citometría de flujo. Se pueden utilizar varios tipos de citómetros de flujo, pero deben estar equipados con el láser correcto (es decir, un láser rojo, rango de excitación ~630 nm) para la excitación y filtros adecuados para la detección de fluoróforos (filtros de emisión ~660 nm). Deben ser capaces de manejar muestras en un formato de placa de 96 pocillos. En la Tabla de Materiales y Reactivos se dan ejemplos de dispositivos de citometría de flujo adecuados.
- Encienda el dispositivo y abra el software correspondiente (consulte la Tabla de materiales y reactivos).
- Seleccione los siguientes parámetros celulares que se visualizarán en un formato de transferencia de puntos: dispersión directa (FSC), dispersión lateral (SSC) y el canal de detección de fluoróforo (CXCL12AF647).
nota: Con el parámetro FSC, las células se discriminan en función de su tamaño, ya que la absorción de luz detectada es proporcional al diámetro de la célula. El parámetro SSC, que mide la dispersión de la luz en un ángulo de 90°, proporciona información sobre la granularidad de las celdas.
- Elija una muestra (por ejemplo, una muestra de control negativa) para realizar la compuerta de una población de células homogéneas definida en función de los parámetros FSC y SSC.
- Seleccione la inyección automática de ~100 μL de células fijadas de esta muestra de control negativo en el citómetro de flujo. Seleccione la opción "mezclar" antes de la inyección y utilice un caudal de muestra de 1,5 μL/s.
- Ejecute este ejemplo seleccionando "Adquirir datos". Los parámetros FSC y SSC para este ejemplo ahora aparecerán en la pantalla.
- Seleccione la herramienta de compuerta del software. Sobre la base de la visualización de manchas de puntos FSC y SSC, predefina una población de células homogénea y viable mediante compuertas. Para ello, cree un polígono (utilizando la herramienta de compuerta del software) que incluya las celdas individuales distribuidas homogéneamente ("eventos") basadas en estas dos dimensiones.
nota: El procedimiento de compuerta tiene como objetivo definir una población celular homogénea y viable que se utilizará para análisis posteriores. La compuerta se basa en la suposición de que la mayoría de las células viables formarán una población celular homogénea basada en los parámetros FSC y SSC. Al realizar este paso, los desechos celulares, las células muertas y los agregados celulares se pueden excluir en gran medida del análisis posterior. En la Figura 1B se muestra una ilustración del proceso de compuerta.
- Seleccione esta opción para analizar 20.000 "eventos" (es decir, células individuales) por muestra.
nota: Esto significa que, por cada muestra, se analizarán finalmente 20.000 células que se encuentran dentro de la puerta predefinida. La adquisición de datos para cada muestra continuará hasta que se analice este número de eventos.
- Inicie la ejecución (seleccione "Registrar datos"). El dispositivo de citometría de flujo ahora analizará todas las muestras una por una registrando la intensidad de fluorescencia media (MFI) para cada muestra. Este MFI corresponde a la señal fluorescente media correspondiente a las 20.000 células que se encuentran dentro de la puerta predefinida.
