1. Generación de un plásmido que expresa el constructo quimérico
>NOTA: El objetivo es generar un plásmido que exprese el dominio extracelular del receptor de interés fusionado con los dominios transmembrana e intracelular de la cadena CD3ζ del ratón (Figura 1A).
- Recupera la secuencia del dominio extracelular del receptor de interés, incluido el péptido señal. Obtener material de ADN que se espera que exprese este receptor (por ejemplo, ADNc o un plásmido).
- Obtener material de ADN que expresa la transmembrana y los dominios intracelulares de la cadena CD3ζ del ratón (por ejemplo, ADNc o un plásmido).
- Diseñe la secuencia de la proteína de fusión en función de la estructura general que se muestra en la Figura 1A. Asegúrese de que toda la secuencia esté dentro del mismo marco de lectura del codón. Esta secuencia se utiliza para diseñar los cebadores apropiados y verificar el producto final.
- Diseñar dos reacciones de PCR para amplificar cada uno de los fragmentos de las proteínas de fusión por separado (Figura 1B, 1C).
nota: Las condiciones específicas para las reacciones de PCR (por ejemplo, tiempo de elongación y temperatura de recocido) dependen de la naturaleza de los cebadores, que están diseñados para un receptor específico.
- Amplificar el segmento extracelular del receptor.
- Diseñe un cebador 5' que incluya parte del péptido señal del receptor, una secuencia de consenso de Kozak y un sitio de restricción apropiado (Figura 1B).
- Diseñe un cebador 3' que flanquee ambas partes de la proteína de fusión (Figura 1B). Por ejemplo, para el diseño inicial, este cebador 3' puede incluir los últimos 20 pares de bases del segmento extracelular del receptor y los primeros 9 pares de bases del segmento CD3ζ.
nota: No es necesario agregar un sitio de restricción al cebador 3', ya que este cebador se utilizará para generar la secuencia fusionada y no se utiliza para la ligadura.
- Amplifique el segmento CD3ζ.
- Diseñe un cebador 5' que flanquee ambas partes de la proteína de fusión (Figura 1C). Por ejemplo, para el diseño inicial, el cebador 5' puede incluir los últimos 9 pares de bases del segmento extracelular del receptor y los primeros 20 pares de bases del segmento CD3ζ.
nota: No es necesario agregar un sitio de restricción al cebador 5' ya que este cebador se usará para generar la secuencia fusionada y no se usa para la ligadura.
- Diseñe un cebador de 3' que incluya el final de la secuencia de CD3ζ, así como un sitio de restricción apropiado (Figura 1C).
- Corrija las secuencias del cebador en cada una de estas dos reacciones para que la temperatura de recocido sea similar en cada par (tenga en cuenta que el cebador, que incluye secuencias de las dos partes de la proteína de fusión, solo recocido con parte de la secuencia en cada reacción).
- Realizar una PCR adicional en la que se utilice una mezcla de los productos de PCR de las dos primeras reacciones como molde de ADN con el cebador 5' del segmento del receptor extracelular (Paso 1.4.1.1) y el 3' del segmento CD3ζ (Paso 1.4.2.2) (Figura 1D). Esta reacción debería generar la secuencia final fusionada.
- Proceda como de costumbre para la clonación.
- Ligue el producto final de PCR al vector de corte objetivo (el vector objetivo suele ser pcDNA3, que expresa resistencia a G418 y ampicilina).
- Transformar el vector ligado en bacteria competente.
- Descongele 50 μL de las bacterias competentes en hielo.
- Agregue el vector ligado a la bacteria e incube en hielo durante 20 min.
- Incubar a 42 °C durante 45 s.
- Añadir 200 μL de LB sin antibióticos.
- Incubar durante 1 h a 37 °C con agitación continua.
- Siembra en una placa de LB con los antibióticos apropiados (por ejemplo, solución de ampicilina con una concentración final de 0,1 mg/mL).
- Recoja y cultive varias colonias bacterianas en 5 mL de LB (en tubos de 15 mL).
- Al día siguiente, extraiga los plásmidos con un minikit de preparación.
- Analice el inserto genético con enzimas de restricción.
- Secuenciar las colonias relevantes y verificar que la secuencia y el marco de lectura sean correctos (como se indica en el paso 1.3).
- Transformar el plásmido verificado en bacterias competentes.
- Descongele 20 μL de las bacterias competentes en hielo.
- Añadir 1 μL del plásmido a las bacterias e incubar en hielo durante 20 min.
- Incubar a 42 °C durante 45 s.
- Añadir 200 μL de LB sin antibióticos.
- Incubar durante 1 h a 37 °C con agitación continua.
- Siembra en una placa de crecimiento bacteriano con los antibióticos apropiados (p. ej., solución de ampicilina con una concentración final de 0,1 mg/mL).
- Al día siguiente, cultive una colonia bacteriana en un recipiente grande de LB con 0,1 mg/mL de ampicilina (~250 mL).
- Al día siguiente, realice la preparación maxi de acuerdo con las instrucciones específicas proporcionadas por el kit.
nota: Para el procedimiento de electroporación, se requiere una gran cantidad de plásmido, como se detalla a continuación.
>2. Transfección del plásmido que expresa la proteína quimérica en células BW
>NOTA: También se pueden emplear diferentes métodos para la transfección (por ejemplo, por infección lentiviral). Antes de la electroporación, realice la precipitación de etanol del ADN como se describe a continuación. Los siguientes pasos requieren condiciones estériles.
- El día anterior, prepare las celdas BW5147 ("celdas BW") para la electroporación. Placa 10 placas (de 10 cm) con 10 mL de 100.000 células/mL BW5147 (es decir, un total de 10 x 106 células) con RPMI suplementado con un 10% de suero fetal de ternera (FCS), un 1% de piruvato de sodio, un 1% de L-glutamina, un 1% de aminoácidos no esenciales y un 1% de penicilina-estreptomicina ("medio completo").
- Coloque 100 μg del plásmido pcDNA3 que expresa la proteína de fusión en un tubo de 1,5-2 mL y agréguele acetato de sodio 3 M a pH 5,3-5,5. El volumen del acetato de sodio debe corresponder al 0,1 (10%) del volumen del plásmido de 100 μg; ajustar el pH del acetato de sodio con un medidor de pH añadiendo NaOH o HCl.
- Agregue 2,5 volúmenes de etanol al 100% a la mezcla del plásmido y el acetato de sodio como se describe en el paso 2.2 (2,5 veces el volumen total de plásmido y acetato de sodio). Incubar durante la noche a -20 °C o durante 2 h a 70 °C.
- 24 h después de que se hayan sembrado las células de peso corporal, recoja todas las células de peso corporal (~100 ml) en 2 tubos de 50 ml. Centrifugar las células durante 5 min a 515 x g y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet de ambos tubos en 25 mL de RPMI, en un solo tubo de 50 mL. Por ejemplo, vuelva a suspender el pellet de un tubo con 25 mL de RPMI- y luego use este fluido para volver a suspender el fluido en el otro tubo de 50 mL de modo que el pellet total de las celdas BW se vuelva a suspender en 25 mL de medio en un solo tubo.
nota: El medio debe ser sin adiciones, ya que el suero podría interferir con la electroporación.
- Vuelva a centrifugar las células durante 5 min a 515 x g. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de RPMI y transfiera el contenido a una cubeta de 0,4 cm en hielo.
- Centrifugar el plásmido que se sometió a precipitación de etanol (Paso 2.3) durante 30 min a 16.000 x g y 4 °C.
- Lavar una vez con 1 mL de etanol al 70% y centrifugar durante otros 20 min a 16.000 x g y 4 °C (para lavar la sal).
- Retire todo el etanol y deje que el pellet se seque ligeramente (es decir, en un tubo abierto en la campana de cultivo de tejidos). Vuelva a suspender el pellet con 100 μL de RPMI, previamente calentado a 60 °C.
- Agregue el plásmido resuspendido (Paso 2.8) a las celdas en la cubeta e incube durante 5 minutos en hielo.
- Electroporar las celdas a 0,23 kV, 250 de capacitación. Esto debería tardar ~4 ms.
- Transfiera las celdas electroporadas a un tubo de 50 mL, agregue 50 mL de medio completo y centrifugue durante 5 min a 5,15 x g.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 50 mL de medio completo.
- Coloque las células electroporadas en placas de cultivo de 24 pocillos (1 mL por pocillo, para un total de ~50 pocillos) e incube a 37 °C y 5% de CO2 durante 48 h.
- Seleccione las células transfectadas con antibióticos. Después de 48 h, agregue 1 mL de medio completo suplementado con 10 mg/mL de G418 a cada pocillo (en esta etapa el volumen final en cada pocillo es de 2 mL y la concentración final de G418 en cada pocillo es de 5 mg/mL)
nota: Si el plásmido contiene una resistencia a los antibióticos diferente, determine la concentración de antibiótico necesaria para matar las células BW no transfectadas antes de este paso.
- Cada 48 h, deseche cuidadosamente 1 mL del volumen superior de cada pocillo sin remover el medio en el pocillo (las celdas de BW tienden a estar en el fondo del pocillo). Agregue medio completo suplementado con 5 mg/mL de G418 a cada pocillo, de modo que el volumen final en cada pocillo sea nuevamente de 2 mL.
- Examine regularmente las placas de cultivo para el crecimiento celular en todos los pocillos.
nota: Un cambio en el color del medio a amarillo puede ayudar a identificar las células en crecimiento; sin embargo, al principio, el medio será amarillo debido al propio G418. Identifique los pocillos positivos (pocillos con células en crecimiento). Estos pocillos son resistentes a G418 y, por lo tanto, se espera que expresen la proteína de fusión. Este proceso suele tardar ~3 semanas.
>3. Verificación de la expresión del receptor transfectado en las células de los pozos positivos.
- Tiñir las células BW transfectadas con un anticuerpo específico contra el receptor que se transfectó.
- Comparar el nivel de expresión del receptor por citometría de flujo con la expresión de las células control (células BW no transfectadas).
- Después de la verificación de uno o más pocillos, use las celdas inmediatamente para fines experimentales, cultívelas en cultivo o congélelas para aplicaciones futuras.
- Verificar la expresión del receptor transfectado antes de realizar un nuevo experimento. Después de unas semanas de crecimiento, las células con G418 con una expresión estable del receptor, G418, se pueden omitir del medio de cultivo.
>4. Incubación de las células BW transfectadas con dianas
NOTA: Cuando se utilizan las células BW transfectadas por primera vez, es preferible probarlas en dianas que expresan un ligando conocido del receptor de interés o en anticuerpos unidos a placas dirigidos específicamente contra el receptor de interés (experimentos de reticulación; véase más abajo, sección 4.2.1.3).
- Preferiblemente, divida las células BW 24 h antes del experimento (por ejemplo, añadiendo 10 mL de medio completo a 2 mL de células en cultivo en una nueva placa de cultivo de 10 cm).
- Incubar las células BW transfectadas con sus dianas. Realice el experimento simultáneamente en células BW de control que expresen un vector vacío (o células BW parentales). Las placas 96F son preferibles (pero también se pueden usar placas 96U). Realice el experimento por triplicado. Suspenda todas las celdas en el medio completo.
- Prepara los objetivos. El tipo de diana varía en función del objetivo y pueden ser células, células que han sido preincubadas con anticuerpos o anticuerpos solos. Este sistema también se ha utilizado con bacterias como objetivos.
- Si los objetivos son células en división (es decir, líneas celulares), irradiarlas a 6.000 rad antes del ensayo. Coloque 50.000 de las células objetivo en un solo pocillo de una placa de 96 (en un volumen de 100 μL).
- Para experimentos con anticuerpos y células BW que expresan FcγRs humanos, incube las células objetivo con un anticuerpo en hielo en una placa de 96 pocillos (por ejemplo, 50 μL de las células objetivo y 50 μL del anticuerpo; se pueden probar diferentes dosis de anticuerpos).
- Si se utilizan anticuerpos solos como dianas (experimentos de reticulación), deben estar unidos a placas. Para ello, primero se deben incubar los anticuerpos en un medio completo en una placa de 96F durante 1-2 h a 37 °C y 5% de CO2 (una dosis inicial típica es de 0,5 μg de un anticuerpo específico en 50 μL). Lave la placa para eliminar los anticuerpos no unidos.
nota: En este caso, una placa 96F permitirá la unión del anticuerpo a la placa, que después de la adición de las células BW transfectadas conducirá a la activación del receptor transfectado.
- Agregue las celdas BW (celdas efectoras). Coloque 50.000 células de BW en un solo pocillo de una placa de 96 (en un volumen de 100 μL).
- Complete el volumen de cada pocillo a 200 μL si es necesario.
- Incubar las placas a 37 °C y 5% de CO2 durante 48 h (este período de tiempo se puede calibrar).
- Después de 48 h, congele las placas a -20 °C y descongélelas antes de ELISA, o utilícelas inmediatamente para ELISA (consulte los pasos siguientes).
5. ELISA
- Cubra una placa ELISA con un anticuerpo anti-ratón IL-2 (anti-mIL-2). Coloque 0,05 μg de anti-mIL-2 en un volumen de 50 μL de 1x PBS (solución salina tampón de fosfato) por pocillo. Incubar la placa ELISA recubierta con el anticuerpo anti-mIL-2 a 4 °C durante la noche o a 37 °C durante 2 h.
nota: Para realizar ELISA directamente después de la etapa de incubación, la placa ELISA debe recubrirse 24 h antes del final del período de incubación de las células BW.
- Deseche el líquido en la placa ELISA y agregue una solución de bloqueo (200 μL por pocillo) que esté compuesta por 1x PBS y 1% de albúmina sérica bovina (BSA). Incubar la placa ELISA durante 2 h a temperatura ambiente.
- Lave la placa ELISA tres veces con una solución Tween de PBS al 0,05% (es decir, 0,5 ml de Tween-20 en 1 litro de 1x PBS).
- Tome la placa 96 que tiene las células BW que se incubaron con sus objetivos (4.3). Si la placa estaba congelada, descongélela completamente (por ejemplo, mediante una incubación corta a 37 °C). Centrifugar la placa de 96 pocillos (5 min, 515 x g) y transferir cuidadosamente 100 μL del sobrenadante en cada pocillo a la placa ELISA prerrevestida y bloqueada.
nota: El sobrenadante debe recogerse de los lados de cada pocillo para evitar que se lleven las células.
- Si lo desea, agregue mIL-2 recombinante con concentraciones definidas a una de las filas vacías de la placa ELISA recubierta para generar una curva estándar de mIL-2. Por ejemplo, se comienza con una concentración de mIL-2 de 2.500 pg/mL y luego se disminuye en un 50% en cada pocillo subsiguiente; no agregue mIL-2 al último pocillo.
- Incubar la placa ELISA a 4 °C durante la noche o a 37 °C durante 2 h.
- Lave la placa ELISA cuatro veces con PBS Tween.
- Agregue biotina anti-ratón IL-2 a la placa ELISA. Utilice una concentración de 1 μg de anticuerpo en 1 mL de 1x PBS con 1% de BSA y divida en 100 μL por pocillo.
- Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Lave la placa ELISA seis veces con PBS Tween.
- Añadir estreptavidina conjugada con HRP. Utilice una concentración de 1 μL de estreptavidina en 1 mL de PBSX1 con 1% de BSA y divídala en 100 μL por pocillo.
- Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Lave la placa ELISA seis veces con PBS Tween.
- Añadir 100 μL por pocillo de solución de sustrato TMB. Complete esta etapa rápidamente para minimizar las diferencias entre los pozos debido a los retrasos de tiempo en la adición del TMB.
- Lea la placa ELISA con un lector de placas ELISA a 650 nm (la lectura se puede repetir si la señal es débil).
