Sonda de fuerza de biomembrana para cuantificar las interacciones receptor-ligando

Resumen

Fuente: Chen, Y., et al., Sonda de fuerza de biomembrana de fluorescencia: cuantificación concurrente de la cinética del ligando receptor y la señalización intracelular inducida por la unión en una sola célula. J. Vis. Exp. (2015)

En este video, se utilizan sondas de fuerza de biomembrana (BFP) para medir las fuerzas entre receptores y ligandos. Esta técnica puede detectar interacciones mediante el monitoreo de la presión necesaria para romper los enlaces entre el pMHC conjugado en las perlas de la sonda y los TCR en las celdas objetivo.

Protocolo

>1. Aislamiento de glóbulos rojos humanos, biotinilación y ajuste de la osmolaridad

NOTA: El paso 1.1 debe ser realizado por un profesional médico capacitado, como una enfermera, con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional.

1. Obtener 8-10 μl (una gota) de sangre de un pinchazo en el dedo y añadirla a 1 ml del tampón de carbonato/bicarbonato (Lista de materiales). Agitar suavemente o pipetear la mezcla y centrifugar durante 1 min a 900 x g. Deseche el sobrenadante y lave una vez más.
2. En un vaso de precipitados pequeño pesa 3,5-4 mg de enlazador de biotina-PEG3500-NHS (Lista de materiales). Disuélvalo en el tampón de carbonato/bicarbonato para obtener la concentración final de 3 mg/ml.
3. Mezclar 171 μl de tampón de carbonato/bicarbonato, 10 μl de paquete de glóbulos rojos y 1049 μl de solución enlazadora de biotina-PEG3500-NHS e incubar a RT durante 30 min. Lave el glóbulo rojo una vez con tampón de carbonato/bicarbonato y luego dos veces con tampón N2-5% (Lista de materiales).
4. Mientras tanto, coloque la botella de enlace con la tapa aflojada en un desecador de vacío de vidrio lleno de desecantes en el fondo y aspire durante 5 minutos, y llene el desecador con argón. Apriete la tapa y saque la botella. Selle la botella con una película plástica de parafina (Lista de materiales), colóquela en un recipiente lleno de desecantes en el fondo y guárdela a -20 °C.
   nota: Los pasos que implican el uso del enlazador Biotina-PEG3500-NHS, incluidos los puntos 1.2-1.4 (excepto la incubación y el lavado en 1.3), deben realizarse lo más rápido posible.
5. Diluir la nistatina en tampón N2-5% hasta obtener una concentración final de 40 μg/ml. Mezclar 5 μl de glóbulos rojos biotinilados con 71,4 μl de solución de nistatina (Lista de materiales) e incubar durante 1 hora a 0 °C. Lavar dos veces con tampón N2-5% y almacenar con tampón N2-5% + 0,5% BSA (Lista de materiales) en el frigorífico (4 °C).

>2. Silanización de cuentas de vidrio

1. Limpieza de la superficie del cordón
   1. Pesar 50 mg de perlas de vidrio en polvo y volver a suspenderlas en 500 μl de agua desionizada.
   2. Mezclar 0,5 ml de H₂O₂ al 30% (lista de materiales) con 9,5 ml de agua desionizada en un vaso de precipitados de 50 ml, añadir 2 ml de NH₄OH concentrado (lista de materiales) y llevar esta solución a una caldera en una placa calefactora.
   3. Agregue las perlas de vidrio a la solución hirviendo y continúe hirviendo durante otros 5 minutos. Agite suavemente la solución cada minuto.
   4. Después de hervir, transfiera ~ 5 ml de esta suspensión de perlas calientes a un tubo de microcentrífuga de 15 ml y rellene con agua RT DI. Centrifugar a 3.500 x g durante 5 min, retirar y desechar el sobrenadante.
   5. Transfiera otros 5 ml de suspensión de perlas calientes y agréguelas a las perlas lavadas, rellene con más agua desionizada, mezcle bien y centrifugue nuevamente. Repita este procedimiento hasta que se utilicen unos 50 ml de agua desionizada, lo que supondrá un total de 4 a 5 lavados.
   6. Transfiera la suspensión de perlas a un vial de 1 ml. Repetir el lavado de las perlas con metanol (Lista de materiales) por centrifugación a 17.000 x g durante 5 min 3 veces, y finalmente volver a suspender las perlas en 1 ml de metanol 100%.
2. Tiolación de la superficie del cordón
   1. A un tubo de centrífuga de 50 ml añadir 45,6 ml de metanol, 0,4 ml de ácido acético (Lista de materiales), 1,85 ml de agua desionizada, 1,15 ml de 3-Mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS) (Lista de materiales) y 1 ml de suspensión de perlas preparada en 2.1, e incubar en RT durante 3 horas.
   2. Después de la reacción, retire todos los reactivos lavándolos una vez con metanol fresco y vuelva a suspender las perlas en 500 μl de metanol. Divida uniformemente esta suspensión concentrada de perlas de vidrio en un juego de 20 viales de vidrio secos y limpios con tapones de rosca. Evapore el metanol usando un chorro de argón seco y gire lentamente los viales para hacer una capa delgada de perlas secas en los lados de cada vial.
   3. Coloque los viales de perlas en un horno de secado precalentado a 120 °C durante 5 minutos y luego saque y coloque rápidamente la(s) tapa(s) sin apretar. Coloque los viales en un desecador de vacío de vidrio lleno de desecantes en el fondo y aspire el desecador con una bomba de vacío hasta que se enfríe.
   4. Purgue el desecador aspirado con argón seco para llevar el desecador a la presión atmosférica normal. Retire la tapa del desecador y vuelva a apretar rápidamente las tapas del vial. Selle los viales con una película plástica de parafina y guárdelos en RT en una caja de almacenamiento seca y oscura.
   5. Tras su uso inmediato, tome un vial de perlas secas y lávese una vez con tampón de fosfato (lista de materiales), vuelva a suspenderlo en 50 μl de tampón de fosfato y almacene a 4 °C. Esta preparación de perlas concentradas se denominará "perlas MPTMS" en los siguientes pasos.
      nota: Con el almacenamiento adecuado, las perlas MPTMS podrían seguir funcionando hasta tres meses.

>3. Funcionalización de cuentas

1. Recubrimiento covalente de proteínas en perlas
   1. Tome un cierto volumen (por ejemplo, 2,5 μl) de la reserva de proteínas y mézclelo con un volumen igual de tampón de carbonato/bicarbonato para hacer la solución 1.
      nota: El volumen depende de la concentración de stock y de la densidad deseada del sitio final de la proteína en la superficie de las perlas.
   2. En un vaso de precipitados pequeño, pesar 2-3 mg de enlazador MAL-PEG3500-NHS (lista de materiales) y disolverlo con tampón de carbonato/bicarbonato hasta alcanzar una concentración final de 0,231 mg/ml.
   3. Mezcle la solución 1 con un volumen igual de la solución enlazadora preparada en 3.1.2. Incubar la mezcla en RT durante 30 min para hacer la Solución 2.
   4. Mientras tanto, coloque la botella de enlace con la tapa aflojada en un desecador de vacío de vidrio lleno de desecantes en el fondo y aspire durante 5 minutos, y llene el desecador con argón. Apriete la tapa y saque la botella. Selle la botella con una película plástica de parafina, colóquela en un recipiente lleno de desecantes en el fondo y guárdela a -20 °C.
      nota: Los pasos que implican el uso del enlazador MAL-PEG3500-NHS, incluidos los puntos 3.1.2 a 3.1.4 (excepto la incubación en el punto 3.1.3), deben completarse lo más rápidamente posible.
   5. Mezcle 5 μl de perlas de MPTMS con la solución 2 y agregue tampón de fosfato (lista de materiales) para obtener un volumen final de 250 μl.
   6. Incubar las perlas durante la noche a RT, lavar 3 veces con tampón de fosfato, volver a suspender en 100 μl de tampón de fosfato y almacenar a 4 °C.
2. Preparación de perlas recubiertas de proteína/estreptavidina (SA)
   1. Siga el protocolo 3.1.1-3.1.4.
   2. Mezcle 5 μl de perlas de MPTMS con la solución 2 y 5 μl de solución de 4 mg/ml de estreptavidina-maleimida (SA-MAL) (lista de materiales) y luego agregue tampón de fosfato para obtener un volumen final de 250 μl.
   3. Incubar las perlas durante la noche a RT, lavar 3 veces con tampón de fosfato y, por último, volver a suspenderlas en 100 μl de tampón de fosfato y almacenarlas a 4 °C.
3. Recubrimiento de estreptavidina en perlas de vidrio
   1. Mezclar 5 μl de perlas de MPTMS con 5 μl de solución de SA de 4 mg/ml y añadir 140 μl de tampón de fosfato.
   2. Incubar las perlas durante la noche a RT, lavar 3 veces con tampón de fosfato, volver a suspender en 50 μl de tampón de fosfato y almacenar a 4 °C.
4. Recubrimiento de las perlas recubiertas de SA con una proteína biotinilada
   1. Mezcle 5 μl de perlas recubiertas de SA con la proteína (el volumen depende de la densidad de recubrimiento deseada) y agregue tampón de fosfato para que el volumen final sea de 100 μl.
   2. Incubar la mezcla durante la noche a 4 °C o durante 3 horas a RT, lavar 3 veces con tampón de fosfato y volver a suspender en tampón de fosfato de 50 μl y almacenar a 4 °C.

>4. Preparación de la célula

NOTA: Para purificar las células, siga los protocolos estándar de purificación celular correspondientes al tipo de células en uso, por ejemplo, células T o ciertas líneas celulares.

1. Para los experimentos de fBFP, una vez que se prepara la suspensión celular, agregue Fura2-AM (lista de materiales) disuelto en DMSO en la suspensión celular para alcanzar una concentración final de 2 μM, incube durante 30 min en RT y luego lave una vez. Mantenga esta suspensión de celdas cargada de fluorescencia en la oscuridad hasta su uso.

>5. Preparación para micropipetas y una cámara celular

1. Preparación de micropipetas
   1. Corte tubos largos de vidrio capilar (lista de materiales) con un cortador de vidrio en piezas cortas de alrededor de 3 pulgadas de largo. Monte una pieza en el extractor de micropipetas (Lista de materiales), haga clic en el botón "Tirar" para que la máquina caliente el centro del capilar y el capilar se tire de los dos extremos para hacer dos capilares con puntas afiladas (micropipetas en bruto).
      nota: Siguiendo las directrices del producto, la morfología deseada de la pipeta cruda tiene un cono de 6-8 mm y una punta de 0,1-0,5 μm.
   2. Monte una pipeta en bruto en el soporte de pipetas de la forja de micropipetas (Lista de materiales). Calentar para derretir la esfera de vidrio en la fragua. Inserte la punta de la pipeta cruda dentro de la esfera de vidrio. Enfríe la esfera de vidrio y tire de la pipeta cruda para romperla desde el exterior y dejar su punta dentro de la esfera. Repita este procedimiento hasta obtener el orificio de punta deseado.
      nota: Ejemplos de diámetro interior de la punta de una micropipeta: 2,0-2,4 μm para un RBC, ~1,5 μm para una perla, ~2-4 μm para una célula T y -7 μm para una célula de hibridoma.
2. Construcción de una cámara de celdas
   NOTA: la cámara de la celda está construida sobre la base de un soporte de cámara casero, que consta de dos piezas de cuadrados de metal (cobre / aluminio) y un mango que las une entre sí (Figura 1D).
3. Corte un cubreobjetos de 40 mm x 22 mm x 0,2 mm con un cortador de vidrio en dos piezas de 40 mm x 11 mm x 0,2 mm (cubreobjetos 1 y 2). Pegue el cubreobjetos 1 con grasa a la parte superior del soporte de la cámara de manera que une los dos cuadrados metálicos y, de manera similar, pegue el cubreobjetos 2 en la parte inferior, lo que formará una cámara de celda de cubreobjetos paralela (Figura 1D).
4. Utilice una pipeta para inyectar 200 μl de tampón experimental entre los dos cubreobjetos. Asegúrese de que el tope se adhiera a ambos cubreobjetos. Gire y agite suavemente la cámara para permitir que el tampón toque ambos extremos de la cámara.
5. Inyecte cuidadosamente aceite mineral en ambos lados de la cámara, flanqueando la zona de amortiguación experimental, sellando así el tampón del aire libre. Inyecte suspensiones de perlas de sonda (por ejemplo, perlas recubiertas de pMHC), glóbulos rojos y dianas (por ejemplo, células T) en las regiones superior, media e inferior de la zona de amortiguamiento, respectivamente.

4. Experimento BFP

1. Encienda el microscopio (lista de materiales) y la fuente de luz. Coloque la cámara en la platina principal del microscopio (Figura 1A, D).
2. Instale las tres micropipetas de BFP (Figura 1D. Izquierda: sonda, para agarrar un RBC, derecha: objetivo, para agarrar una célula o cuenta, abajo a la derecha: ayudante, para agarrar una cuenta).
   1. Utilice un microinyector (lista de materiales) para rellenar una micropipeta con un tampón experimental. Retire el soporte de la pipeta (Lista de materiales) y sujételo en un lugar más bajo para permitir que el agua gotee de la punta. Inserte rápidamente la micropipeta en la punta del soporte y asegúrese de que no entre ninguna burbuja de aire en la micropipeta durante la inserción. Apriete el tornillo del sujetador.
   2. Monte cada soporte de pipeta en su micromanipulador correspondiente. Empuje la micropipeta hacia la cámara de modo que sus puntas entren en el área del tampón de la cámara. Ajuste la posición de la micropipeta y encuéntrela bajo el campo de visión del microscopio.
3. Muévase por la etapa del soporte de la cámara para encontrar las colonias de tres elementos (los glóbulos rojos, los objetivos y las cuentas de la sonda) uno por uno. Ajuste la posición de la micropipeta correspondiente girando las perillas de los manipuladores para permitir que la punta de la micropipeta se acerque a una celda/cordón. Aspire la célula/cordón ajustando la presión dentro de la micropipeta correspondiente. Las tres micropipetas capturarán sus elementos correspondientes.
4. Muévase alrededor de la etapa del soporte de la cámara para encontrar un espacio abierto lejos de las colonias de los elementos inyectados donde se realizará el experimento. Cambie el modo visual del microscopio para visualizar la imagen en el programa informático en la pantalla de la computadora. Mueva los tres elementos de las puntas de pipeta al campo de visión del programa.
5. Alinee el cordón de la sonda y el RBC, y maniobre con cuidado el cordón de la sonda hasta el ápice del RBC, golpee brevemente el cordón en el RBC y retraiga suavemente. Ajuste la presión de la micropipeta auxiliar para soplar suavemente el cordón, de modo que quede pegado en el ápice del RBC (Figura 1F). Retire la micropipeta auxiliar y alinee el objetivo y el cordón de la sonda (Figura 2A).
6. En el programa, en la ventana de campo de visión, utilice las herramientas del programa para medir los radios respectivos de la micropipeta de la sonda (Rp), el RBC (R0), el área de contacto circular entre el RBC y el cordón de la sonda (Rc ), lo que permite la estimación de la constante de resorte del RBC (k) mediante la siguiente ecuación, donde Δp es la presión de aspiración en la punta de la pipeta de sonda. Nota: De la ley de Hooke se deduce que la fuerza de unión, F, se puede cuantificar mediante el producto de la constante de resorte y el desplazamiento del cordón de la sonda (d), es decir, F = d (Figura 2C).
   
7. Introduzca la constante de resorte RBC deseada en el programa (consulte la sección 4.6 del Protocolo. La constante de resorte generalmente se establece en 0,25 o 0,3 pN/nm para el ensayo de abrazadera de fuerza y el ensayo de frecuencia de adhesión y 0,1 pN/nm para el ensayo de fluctuación térmica), lo que devolverá una presión de aspiración requerida en la unidad de un centímetro de agua. Ajuste la altura del tanque de agua que se conecta a la pipeta de la sonda hasta alcanzar la presión de aspiración requerida.
8. Dibuje una línea horizontal a través del vértice RBC, lo que producirá una curva en la ventana adyacente que indica el brillo (valor de escala de grises) de cada píxel a lo largo de esta línea. Arrastre la línea de umbral para que esté aproximadamente a la mitad de la profundidad de la curva (Figura 2A, B).
   nota: El punto mínimo en la curva de brillo por debajo de la línea de umbral indica la posición del límite del cordón, por lo que solo se permite un mínimo local. Si hay dos o más mínimos locales en este momento, indica que la imagen no es óptima (probablemente debido a que la imagen está desenfocada o a una mala alineación entre el cordón de la sonda y el RBC).
9. Seleccione el modo de experimento deseado: ensayo de fluctuación térmica, ensayo de frecuencia de adhesión o ensayo de pinza forzada. Ajuste los parámetros como desee (por ejemplo, fuerza de impacto = 15 pN, velocidad de carga = 1.000 pN/s, tiempo de contacto = 1 segundo, fuerza de sujeción = 20 pN (para el ensayo de sujeción de fuerza), etc.).
   1. Haga clic en "Iniciar", lo que permite que el programa mueva la pipeta objetivo y haga que el objetivo entre y salga del contacto con la sonda (consulte la sección Resultados representativos para obtener más detalles). La recopilación de datos se realizará en paralelo, lo que registra la posición del cordón de la sonda en tiempo real. Detenga el programa haciendo clic en el botón "Detener experimento", momento en el que aparecerá una ventana que permitirá guardar los datos adquiridos.

Resultados

Figura 1: Montaje fBFP.

(A) Una imagen general del sistema de hardware fBFP. (B) Un dibujo esquemático del sistema de hardware fBFP. (C) El sistema de doble cámara "DC2" (naranja) en el que se montaron la cámara de alta velocidad (azul) y una cámara de fluorescencia (blanca). (D) La etapa de microscopio q...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fosfato de sodio monobásico monohidratado (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Preparación de tampones de fosfato
Anhy. Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Preparación de tampones de fosfato
Carbonato de sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Preparación de tampones de carbonato/bicarbonato
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Preparación de tampones de carbonato/bicarbonato
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Preparación del tampón N2-5%
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Preparación del tampón N2-5%
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655	Preparación del tampón N2-5%
sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389	Preparación del tampón N2-5%
MAL-PEG3500-Servicio Nacional de Salud (NHS	JenKem	A5002-1	Funcionalización de cuentas
Biotina-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	Biotinilación de glóbulos rojos
Nistatina	Sigma-Aldrich	N6261	Ajuste de la osmolaridad de los glóbulos
Hidróxido de amonio (NH4OH)	Sigma-Aldrich	A-6899	Silanización de perlas de vidrio
metanol	BDH	67-56-1	Silanización de perlas de vidrio
30% Peróxido de hidrógeno (H2O2)	J. T. Barker	Ene-86	Silanización de perlas de vidrio
Ácido Acético (Glacial)	Sigma-Aldrich	ARK2183	Silanización de perlas de vidrio
3-Mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS)	Uct Specialties, llc	4420-74-0	Funcionalización de perlas de vidrio
Perlas de vidrio de borosilicato	Tecnología de partículas Distrilab	9002	Funcionalización de perlas de vidrio
Estreptavidina-Maleimida	Sigma-Aldrich	S9415	Funcionalización de perlas de vidrio
Bsa	Sigma-Aldrich	A0336	Funcionalización de ligandos
Fura2-AM	Tecnologías de la Vida	F-1201	Carga de colorante de fluorescencia de calcio intracelular
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Carga de colorante de fluorescencia de calcio intracelular
Cuentas de PE Quantibrite	BD Biociencias	340495	Cuantificación de la densidad
Tubo capilar 0.7-1.0 mm x 30 pulgadas	Persecución de Kimble	46485-1	Fabricación de micropipetas
Extractor de micropipetas aplanada/marrón	Instrumento Sutter	P-97	Fabricación de micropipetas
Narishige	Narishige	Narishige	Fabricación de micropipetas
Aceite mineral	Fisher Científico	BP2629-1	Montaje de la cámara
Cubierta de vidrio para microscopio	Fisher Científico	12-544-G	Montaje de la cámara
Microinyector	Instrumentos de precisión mundial	MF34G-5	Montaje de la cámara
Jeringa de 1 ml	Bd	309602	Montaje de la cámara
Soporte para micropipetas	Narishige	HI-7	Montaje de la cámara
Microscopio (TiE invertido)	Nikon	MEA53100	Sistema BFP
Objetivo CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)	Nikon	MRH00401	Sistema BFP
Cámara, GE680, 640 x 480, GigE, CCD de 1/3", monocromo	Imágenes de Graftek	02-2020C	Sistema BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", montura C, 1280 x 960, monocromo, CCD, ADC de 12 bits	Imágenes de Graftek	02-2185A	Sistema BFP
Cabezal de sonda submicrónico manual con control remoto de alta resolución	Karl Suss	PH400	Sistema BFP
Mesa antivibratoria (5' x 3')	TMC	77049089	Sistema BFP
Etapa de traslación manual 3D	Newport	462-XYZ-M
Software CAD 3D de SolidWorks	Software CAD 3D de SolidWorks	Versión 2012 SP5	Sistema BFP
Software LabVIEW	Instrumentos Nacionales	Versión 2009	Sistema BFP, programa BFP
Etapa de traslación piezoeléctrica 3D	Physik Instrumente	M-105.3P	Sistema BFP
Accuador piezoeléctrico lineal	Physik Instrumente	P-753.1CD	Sistema BFP
Tampón de carbonato/bicarbonato (pH 8,5)			8,4 g/L de carbonato de sodio (Na2CO3), 10,6 g/L de bicarbonato de sodio (NaHCO3)
Tampón N2-5% (pH 7,2)			27,6 g/L NaFosfato monobásico (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfato dibásico (Na2HPO4)
			20,77 g/L de cloruro de potasio (KCl), 2,38 g/L de cloruro de sodio (NaCl), 0,13 g/L de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4), 0,71 g/L de fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4), 9,70 g/L de sacarosa