Ensayo de unión de competición para estudiar socios de proteínas de unión a GTPasa que compiten entre sí

Resumen

Fuente: Williamson, R. C., et al. Comparación de la afinidad de las proteínas de unión a GTPasa mediante ensayos de competencia. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra un ensayo de competencia para estudiar las proteínas asociadas a la GTPasa. Utilizando la proteína GTPasa unida a nucleótidos inmovilizada en perlas magnéticas, se puede estudiar la unión competitiva entre dos proteínas asociadas que interactúan para el mismo sitio de unión en la GTPasa para evaluar las afinidades de unión de las proteínas asociadas.

Protocolo

>1. Purificación de GTPasa marcada con GST

1. Cultivo de una cepa de E. coli como BL21 transformada con pGEX-Rac1 O/N a 37 °C, agitando a 220 rpm, en 500 ml de medios de autoinducción (25 mM Na₂HPO₄, 25 mM KH₂PO₄, 50 mM NH₄Cl, 5 mM Na₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 0,5% glicerol, 0,05% glucosa, 0,2% lactosa, 5 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 100 μg/ml de ampicilina).
2. Recolección de bacterias por centrifugación durante 10 min a 10.000 x g, 4 °C.
3. Vuelva a suspender el pellet bacteriano en 20 ml de reactivo de extracción de proteínas, 1x inhibidor de la proteasa, e incube durante 20 min en RT con inversión.
4. Clarificar el lisado por centrifugación a 40.000 x g durante 30 min.
5. Añadir 2 ml de perlas magnéticas de glutatión, lavadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS: 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
6. Incubar durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 °C.
7. Lave las perlas cargadas de proteínas cuatro veces con 10 ml de PBS, utilizando un clasificador de partículas magnético para precipitar las perlas en cada paso.
8. Vuelva a suspender las perlas cargadas de proteínas en 2 ml de PBS y almacene a -80 °C en alícuotas de 100 μl hasta que las necesite.

>2. Expresión de proteínas de unión a GTPasa

1. El día antes del experimento, transfectaron plásmidos que codifican las versiones marcadas con la proteína fluorescente verde (GFP) de cada proteína de unión a GTPasa en un matraz separado de 75^cm2 de HEK293T de la siguiente manera. Para validar la carga de nucleótidos, transfecte TrioD1 marcado con GFP en un tercer matraz de HEK293T de^{75 cm2}.
   1. Diluir polietilamina a 1 mg/ml en 100 μl de NaCl estéril de 150 mM.
   2. Añadir 27 μl de polietilamina diluida a 223 μl de medios séricos reducidos.
   3. Añadir 12 μg de ADN plasmídico a 250 μl de medio sérico reducido.
   4. Incube cada tubo durante 2 minutos a RT.
   5. Combine las mezclas de polietilamina y ADN en un solo tubo y vórtice durante 2 minutos.
   6. Incubar durante 15-20 min en RT.
   7. Reemplace el medio de crecimiento (Dulbecco's Modified Eagle Media, 10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, sin antibióticos) en HEK293T confluente al 90% con 5 ml de medios de crecimiento frescos.
   8. Añadir la mezcla combinada de polietilamina/ADN al matraz e incubar O/N a 37 °C, 5% CO₂.

>3. Purificación de proteínas de unión a GTPasa

1. Enjuague los matraces de células transfectadas en PBS y drene el matraz durante 5 min, aspirando líquido libre.
2. Raspe las células en tampón de lisis de 500 μl (50 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x inhibidor de la proteasa) en un tubo de microfuga.
3. Lisar las células mezclando por inversión a 4 °C durante 30 min.
4. Durante la lisis, lavar tres veces dos lotes de 40 μl de perlas GFP-Trap con tampón de lisis fresco, sedimentando las perlas a 2.700 x g durante 2 min entre lavados.
5. Clarificar los lisados por centrifugación a 21.000 x g durante 10 min.
6. Transfiera el lisado clarificado de cada una de las proteínas competidoras a perlas de trampa de GFP lavadas separadas y permita que las proteínas de fusión de GFP se unan durante 2 horas, mezclándose por inversión a 4 °C. Mantenga el lisado de las células GFP-TrioD1 en hielo.
7. Lave las perlas cargadas de GFP-Trap dos veces en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM de NaCl, 0,7% (p/v) de Nonidet P-40 y dos veces en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl₂, sedimentando las perlas a 2.700 x g durante 2 min entre lavados.
8. Eluir las proteínas de fusión de GFP añadiendo 40 μl de glicina 0,2 M (pH 2,5) y pipetear hacia arriba y hacia abajo durante 30 seg. Sedimente inmediatamente las perlas a 21.000 x g durante 60 s y transfiera el líquido a un nuevo tubo de microfuga que contenga 4 μl 1 M de Tris-HCl (pH 10,4). Haga esto rápidamente para limitar el daño a la proteína purificada.
9. Analice 1 μl de cada proteína purificada mediante Western blot y pruebe con un anticuerpo anti-GFP para establecer el rendimiento relativo utilizando un sistema de transferencia cuantitativa de acuerdo con el protocolo del fabricante. Alternativamente, determine las concentraciones de proteínas mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA), pero esto introduce errores si las proteínas no reaccionan con el ensayo de manera idéntica o si hay proteínas contaminantes.
10. Igualar la concentración de proteínas molares mediante la adición de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6) y 20 mM de MgCl₂.

>4. Carga de nucleótidos de GTPasa

1. Descongele una alícuota de perlas magnéticas GST-Rac1, preparadas en el paso 1.
2. Tome 90 μl de perlas de GST-Rac1 y lávelas tres veces con 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM de NaCl, 0,1 mM de DTT y 4 mM de EDTA, utilizando un clasificador de partículas magnéticas para precipitar las perlas en cada paso.
3. Aspire el tampón de las perlas y agregue 100 μl de Tris-HCl de 20 mM (pH 7,6), 25 mM de NaCl, 0,1 mM de DTT y 4 mM de EDTA.
4. Dependiendo de si se requiere GDP, GTP o no se requiere ninguna carga de nucleótidos para el experimento de competencia, agregue 12 μl 100 mM de GDP, 12 μl 10 mM de guanosina 5'-[γ-tio]trifosfato (GTPγS) o ningún nucleótido a 60 μl de gspón GST-Rac1 granos.
5. Para los controles de carga de nucleótidos, divida las perlas restantes en tres alícuotas de 10 μl y agregue 2 μl 100 mM GDP, 2 μl 10 mM GTPγS o ningún nucleótido a cada tubo.
6. Incubar las mezclas de perlas durante 30 min a 30 °C con agitación.
7. Estabilizar el Rac1 unido a nucleótidos mediante la adición de 1 M MgCl₂: 3 μl a la mezcla experimental (paso 4.4) y 0,5 μl a cada una de las mezclas de control (paso 4.5).

5. Encuadernación de competición

1. Coloque 6 tubos de microfuga, cada uno conteniendo:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl₂
   10 μl de perlas Rac1 experimentales cargadas con nucleótidos (a partir del paso 4.7)
   5 μl de proteína A de unión a Rac1 (proteína de unión constante)
2. A cada tubo, agregue 0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 μl de proteína B de unión a Rac1 (proteína de unión variable). Estos volúmenes suponen concentraciones de stock aproximadamente iguales de las proteínas de unión constantes y variables y puede ser necesario ajustarlos.
   1. Ajustar los volúmenes de las proteínas de unión A y B si hay grandes diferencias en las afinidades de unión de las dos proteínas y esto debe determinarse empíricamente a través de las repeticiones experimentales. Aumente el volumen total de la mezcla aglutinante a 235 μl mediante la adición de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6) y 20 mM de MgCl₂.
3. Configure un tubo de microfuga que contenga:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl₂
   10 μl de perlas Rac1 experimentales cargadas con nucleótidos (a partir del paso 4.7)
   10 μl de proteína A de unión a Rac1 (proteína de unión constante)
4. Configure el GDP, GTPγS y sin tubos de control de nucleótidos:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl₂
   10 μl de bolas de control Rac1 cargadas en el paso 4.5 con GDP, GTPγS o sin nucleótido y estabilizadas en el paso 4.7.
   180 μl HEK293T lisado de GFP-TrioD1, preparado como en el paso 3.6
   4 μl 1 M MgCl₂
5. Incubar la mezcla durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 °C.
6. Lave las perlas tres veces con 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6) y 20 mM de MgCl₂.
7. Proteínas unidas a eluidos en tampón reductor de muestra de 20 μl (50 mM de Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glicerol, 0,02 mg/ml de azul de bromofenol, 5% β-mercaptoetanol).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cazador de errores	Novagen	70584-3
Inhibidor de la proteasa COMPLETO	Roche	05 056 489 001
Perlas magnéticas de glutatión	perforar	88821
Polietilenimina, ramificada, promedio Mw ~ 25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Tecnologías de la Vida	31985-047
Medios de águila modificados de Dulbecco	Sigma Aldrich	D5796
Suero Fetal Bovino	Tecnologías de la Vida	10270-1-6
L-Glutamina	Tecnologías de la Vida	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	GTA-20
PIB	Sigma Aldrich	G7127	Altamente inestable. Alícuota y almacenamiento a -80 inmediatamente después de la reconstitución
GTPγS	Sigma Aldrich	G8634	Altamente inestable. Alícuota y almacenamiento a -80 inmediatamente después de la reconstitución
Búfer de bloqueo	Sigma Aldrich	B6429
Preadolescente-20	Sigma Aldrich	P9416
Anticuerpo anti-GFP	Colores vivos	632592	Usar con dilución 1/1000
DyLight 800 anticuerpo secundario conjugado anti-conejo de cabra	Fisher Científico	10733944
Sistema de imágenes infrarrojas Odyssey SA	Li-cor	9260-11PC