Ensayo de microarrays de antígenos virales para detectar isotipos de anticuerpos en suero contra antígenos virales

Resumen

Fuente: Khan, S., et al., Uso de un microarray de antígenos de influenza para medir la amplitud de los anticuerpos séricos en todos los subtipos de virus. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, demostramos el proceso para detectar isotipos de anticuerpos en múltiples muestras de suero humano utilizando un portaobjetos de microarray impreso con subtipos antigénicos de cepas del virus de la influenza.

Protocolo

1. Producir microarrays de antígenos de influenza

1. Impresión de antígenos en portaobjetos de microarrays
   1. Reconstituya cada antígeno liofilizado a una concentración de 0,1 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,001% de Tween-20 (T-PBS). Transfiera 10 μL de cada antígeno reconstituido a pocillos individuales de una placa de fondo plano de 384 pocillos sin tratar.
   2. Imprima antígenos utilizando una impresora de microarrays con clavijas de detección de microarrays de bajo volumen que aspiran el antígeno en el canal de muestra y lo depositan por contacto directo y acción capilar en portaobjetos de vidrio recubiertos de nitrocelulosa de 16 almohadillas.
      1. Programe el software de impresión (por ejemplo, Gridder) con la configuración de la placa de origen y los parámetros de impresión.
         1. Utilice el menú desplegable para seleccionar el nombre del tipo de plancha que se utilizará con este método de impresión. Para este estudio, use una placa de fondo plano de 384 pocillos sin tratar.
         2. Seleccione el cuadro de texto situado junto a Número de planchas y escriba el número de planchas de muestra que se utilizarán en este protocolo de impresión. Para este estudio, utilice 1 plato.
         3. Seleccione una configuración de pin para usarla con este método. Para este estudio, utilice una configuración de 8 pines.
         4. Asegúrese de que los desplazamientos de origen sean las distancias (en las direcciones X e Y) entre el origen de la diapositiva (que está calibrado en la sección Administrativa) y la ubicación donde los pines de impresión comenzarán a imprimirse en las diapositivas.
         5. Con la pestaña Diseño de matriz, defina el tamaño y la forma de las matrices (espaciado de puntos y el número de puntos por submatriz). Para este estudio, imprima 324 puntos (180 μm de diámetro con un espaciado de 300 μm) en diapositivas de 16 almohadillas en un formato de 18x18 usando 8 pines.
         6. Seleccione los parámetros para la forma en que los pines de impresión recogen y dispensan las muestras. Para este estudio, cada pin aspira 250 nL de solución de antígeno e imprime 1 nL en cada uno de los 40 puntos (un total de 20 portaobjetos para los 8 pines)
         7. Configure el protocolo de limpieza de pines y el protocolo de transferencia. Para este estudio, cada pin imprime el antígeno se sumerge en ddH₂O estéril en un recipiente de lavado sonicado y luego aspira el siguiente antígeno.
         8. Defina la secuencia en la que se imprimen los bloques de muestra en las diapositivas. El software de la matriz construirá un archivo de índice de cuadrícula anotado (.gal) para describir la disposición de los antígenos dentro de cada micromatriz.
            nota: La fila superior se utiliza para que los fiduciales (con fluorescencia en todas las longitudes de onda utilizadas en la obtención de imágenes, por ejemplo, una mezcla de conjugado de estreptavidina Qdot de 585 nm y conjugado de estreptavidina de Qdot de 800 nm en este estudio) orienten las rejillas durante la obtención de imágenes. Para tiradas de impresión largas, los antígenos en la placa fuente se pueden resuspender periódicamente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo y luego centrifugar, o se puede preparar y usar una nueva placa fuente.
   3. Coloque los portaobjetos de microarrays sin sonda en una caja a prueba de luz y manténgalos en un gabinete de desecación a temperatura ambiente para su almacenamiento a largo plazo.
      nota: El protocolo puede estar en pausa indefinida en este punto.
2. Realizar un control de calidad (requiere etiquetas de polihistidina)
   1. Conecte el portaobjetos a las cámaras de sondeo y rehidrate con un tampón de bloqueo como se describe en los pasos 2.1.1-2.1.2 y se muestra en la Figura 1.
   2. Diluir el anticuerpo poli-His monoclonal de ratón 1:100 en tampón de bloqueo 1x filtrado.
      nota: Si se utilizan antígenos proteicos no purificados (por ejemplo, expresados en el sistema de transcripción y traducción in vitro) para imprimir microarrays, se añadan componentes del sistema de expresión de proteínas (por ejemplo, lisado de E. coli) en una proporción de 1:10 con el tampón de bloqueo utilizado para la dilución sérica con el fin de bloquear cualquier anticuerpo dirigido contra estos componentes.
   3. Añadir 100 μL de anticuerpo poli-His diluido a cada cámara de portaobjetos que contenga la almohadilla del array después de la aspiración e incubar durante 2 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C en un agitador. Lave 3 veces con tampón T-TBS como se describe en el paso 2.2.1. Diluir el anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado con biotina 1:200 en tampón de bloqueo, añadir 100 μL por pocillo después de la aspiración e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador. Lavar 3 veces con tampón T-TBS.
   4. Diluya el conjugado de estreptavidina Qdot de 585 nm a 4 nM en tampón de bloqueo, agregue 100 μL por pocillo después de la aspiración e incube durante 1 h a temperatura ambiente en el agitador. Lave 3 veces con tampón T-TBS y, a continuación, una vez con tampón TBS (sin interpolación).
   5. Desmontar y cuantificar las diapositivas como se describe en los pasos 2.2.5 – 3.1.2.
      nota: Los antígenos proteicos deben contener etiquetas His10 para utilizar este protocolo de control de calidad. Alternativamente, si se incluye una etiqueta diferente, se puede realizar un control de calidad con un anticuerpo o ligando para esa etiqueta.

>2. Sueros de sondeo de anticuerpos contra la gripe mediante microarrays

1. Incubar sueros en microarrays para la unión de anticuerpos.
   1. Fije los portaobjetos de microarrays a las cámaras con clips y colóquelos en marcos como se muestra en la Figura 2.
      nota: Evite siempre tocar la almohadilla del microarray con las manos y los instrumentos. Asegúrese de que las correderas estén orientadas con la almohadilla hacia arriba y la pequeña muesca en la esquina superior derecha.
   2. Rehidrate los portaobjetos de microarrays con 100 μL por pocillo de tampón de bloqueo 1x filtrado y diluya el suero 1:100 en 100 μL de tampón de bloqueo (puede utilizar placas de 96 pocillos sin tratar o tubos de 2 mL). Incubar los portaobjetos de microarrays rehidratados en bastidores cubiertos y los sueros diluidos por separado durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100-250 rpm. Realice todos los pasos de incubación posteriores de manera similar en el agitador.
      nota: Los sueros deben alícutus y congelarse a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo a fin de minimizar los ciclos de congelación y descongelación, y deben mezclarse en vórtice para mezclarse y centrifugarse para eliminar las partículas antes de su uso. Observe cuidadosamente las cámaras de portaobjetos durante y después de este paso para detectar cualquier fuga que requiera volver a ensamblar las cámaras de portaobjetos.
   3. Utilizando puntas de pipeta conectadas a una línea de vacío con un matraz de recolección secundario, aspire cuidadosamente el tampón de bloqueo desde la esquina de cada cámara sin tocar las almohadillas. Realice todos los pasos de aspiración posteriores de manera similar. Añada sueros diluidos a las almohadillas rápidamente después de la aspiración para no permitir que las almohadillas se sequen.
   4. Coloque los marcos cubiertos en bandejas dentro de un recipiente secundario rodeado de toallas de papel húmedas y sellado para evitar la evaporación. Incubar durante la noche a 4 °C en un agitador oscilante (alternativamente, puede incubar durante 2 h a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100-250 rpm).
2. Marcar los anticuerpos séricos unidos con anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos
   1. Aspirar cuidadosamente los sueros de las cámaras como se ha descrito anteriormente, añadir 100 μL por pocillo de tampón T-TBS (20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,05% Tween-20 en ddH₂O ajustado a pH 7,5 y filtrado, se puede obtener comercialmente) e incubar durante 5 min en un agitador orbital a 100-250 rpm. Repita este paso de lavado un total de 3 veces (todos los pasos de lavado posteriores se realizan de manera similar).
   2. Prepare una mezcla de anticuerpos secundarios diluidos a 1 μM en tampón de bloqueo y mezcle bien mediante pipeteo antes y durante el uso para mantener la homogeneidad.
      nota: Para mantener la reproducibilidad del ensayo, se debe utilizar el mismo lote de cada anticuerpo secundario para todos los experimentos de sondaje para los que se prevé la comparación cuantitativa de los datos entre experimentos. Es posible que sea necesario variar la concentración específica del anticuerpo secundario en función de la afinidad; Siga los protocolos del fabricante siempre que estén disponibles.
   3. Aspirar el tampón de las cámaras después del lavado final, añadir 100 μL por pocillo de mezcla de anticuerpos secundarios e incubar durante 2 h a temperatura ambiente en un agitador.
   4. Aspire la mezcla de anticuerpos secundarios lavar 3 veces con tampón T-TBS y luego lavar una vez con tampón TBS (sin Tween).
   5. Desmonte los portaobjetos de microarrays de las cámaras con cuidado para evitar tocar las almohadillas, enjuague suavemente con ddH₂O filtrado y seque colocándolos en tubos de 50 ml y centrifugando a 500 x g durante 10 min.
   6. Coloque los portaobjetos de microarrays sondados en una caja a prueba de luz y manténgalos en un gabinete de desecación a temperatura ambiente para su almacenamiento a largo plazo.
      nota: El protocolo puede estar en pausa hasta 1 semana en este punto.

>3. Cuantificar la unión de anticuerpos a antígenos dentro de microarrays

1. Visualice portaobjetos de microarrays y cuantifique la intensidad de la fluorescencia puntual para medir la unión de anticuerpos.
   1. Adquiera imágenes de portaobjetos de microarrays utilizando el generador de imágenes portátil con software incorporado.
      1. En la pestaña Configurar generador de imágenes, seleccione la configuración de diapositiva adecuada. Para este estudio, use portaobjetos de 16 almohadillas.
      2. En la pestaña Control de imagen, seleccione el canal fluorescente adecuado y ajuste la ganancia, el tiempo de exposición y el tiempo de adquisición en función de la reactividad del suero para obtener imágenes óptimas. Para este estudio, los canales fluorescentes para IgA e IgG fueron de 585 nm y 800 nm respectivamente, y los ajustes de imagen fueron ganancia de 50, tiempo de exposición de 500 ms y tiempo de adquisición de 1 s.
      3. Haga clic en Capturar para iniciar el proceso de adquisición de la imagen.
         nota: Las diapositivas de microarrays se pueden volver a visualizar en múltiples configuraciones sin degradación de las señales, siempre y cuando se almacenen oscuras y secas. Se pueden utilizar otros sistemas de imagen si son compatibles con los portaobjetos.
2. Detecte puntos de matriz utilizando cuadrículas orientadas en función de los marcadores de referencia y mida la intensidad del punto como la mediana de la intensidad de píxeles menos el fondo medido alrededor de los puntos. Realice este algoritmo de cuantificación por lotes utilizando el software de generación de imágenes incorporado, que utiliza el archivo .gal construido en el paso 1.1.2 para conectar las intensidades puntuales a los antígenos individuales en cada micromatriz.
   1. En el panel Información de archivo, cargue el archivo .gal seleccionándolo en su carpeta del equipo y especifique la carpeta en la que se guardarán los archivos de salida del análisis en la sección Opciones de análisis.
   2. En la pestaña Control de imagen, abra una de las imágenes adquiridas para cuantificar y seleccione el botón Auto en la esquina superior derecha.
   3. En la sección Análisis de matrices en la esquina inferior derecha, cree una plantilla fiducial según las instrucciones del software.
   4. Haga clic en el Análisis por lotes, seleccione la carpeta que contiene las imágenes a cuantificar y seleccione la plantilla fiducial que se creó en el paso anterior. El software analiza cada imagen y cuantifica la intensidad del punto.
      nota: Este paso generará un archivo de .csv que contiene intensidades puntuales que cuantifican los anticuerpos dentro de cada muestra de suero que se unen a cada antígeno individual en el microarray que posteriormente se puede manipular en la manipulación de hojas de cálculo o en el software de análisis.
3. Analice los datos brutos para comparar la unión de anticuerpos entre antígenos y muestras de suero. Para este estudio, se compararon los anticuerpos IgA e IgG medidos como intensidades de punto fluorescente de 585 nm y 800 nm en todos los antígenos entre 2 ejecuciones independientes del experimento utilizando diferentes portaobjetos en diferentes días, y se realizó un análisis de correlación para medir la reproducibilidad del ensayo
   nota: En el caso de las proteínas no purificadas impresas como mezcla de expresión, el análisis de los datos debe comenzar con la sustracción de fondo de ningún control de ADN.

Resultados

Figura 1: Esquema del protocolo de impresión y sondeo de microarrays de antígenos de influenza. De izquierda a derecha, los micromatrices se imprimen en portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa, que se utilizan para sondear sueros en busca de anticuerpos IgG e IgA utilizando anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos, con portaobjetos visualizados con un generador de im...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
16 almohadillas de vidrio con recubrimiento de nitrocelulosa	Grace Bio Labs	305016
1x Búfer de bloqueo GVS FAST	Fischer Scientific	10485356
ArrayCam generador de imágenes portátil	Grace Bio Labs	400S	Se pueden utilizar otros dispositivos de imagen para visualizar portaobjetos si son capaces de alcanzar la resolución de los puntos de microarrays y las longitudes de onda de excitación y emisión de los puntos cuánticos.
Anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado con biotina	Thermo Fischer	31800
Placa HiBase de 384 pocillos	Greiner Bio-One	T-3037-11
Pines de microarray	ArrayIt	GMP2	Cada impresora de microarrays puede requerir sus propios pines de microarrays personalizados.
Anticuerpo monoclonal poli-His de ratón	Sigma-Aldrich	H1029
OmniGrid 100	GeneMachines		La versión de la impresora de micromatrices utilizada en este trabajo ya no está disponible comercialmente, pero el equipo similar actualizado es la impresora de micromatrices OmniGrid Accent de Digilab (Hopkinton, MA), y el mismo protocolo se puede llevar a cabo con la mayoría de las impresoras de micromatrices disponibles comercialmente.
Cámaras portaobjetos ProPlate	Grace Bio Labs	246890
Clips deslizantes ProPlate	Grace Bio Labs	204838
Marcos deslizantes ProPlate	Grace Bio Labs	246879
Punto cuántico 585 nm anticuerpo anti-IgA humano conjugado en cabra	Grace Bio Labs	110620
Punto cuántico conjugado de estreptavidina de 585 nm	Thermo Fischer
Anticuerpo anti-IgG humano conjugado de 800 nm de punto cuántico	Grace Bio Labs	110610