Microscopía TIRF para visualizar la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos

Resumen

Fuente: Henty-Ridilla, J.L., Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). J. Vis. Exp. (2022)

Este video describe TIRF, una técnica basada en microscopía de reflexión interna total para visualizar la dinámica de polimerización de actina y microtúbulos. El método permite obtener imágenes de alta resolución de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos en tiempo real, lo cual es esencial para comprender las diafonías celulares.

Protocolo

1. Lavar los cubreobjetos

NOTA: Lavar (24 mm x 60 mm, #1.5) cubreobjetos según Smith et al., 2013.

1. Coloque las cubrebocas en un contenedor de plástico para sobres deslizantes.
2. Sumerja los cubreobjetos secuencialmente en las siguientes soluciones y sonique durante 30-60 min, enjuagando con ddH₂O 10 veces entre cada solución: ddH₂O con una gota de jabón para platos; 0,1 M KOH. Guarde los cubreobjetos en etanol 100% hasta por 6 meses.
   nota: No toque las superficies de vidrio con los dedos sin guantes. En su lugar, usa fórceps.

2. Recubrimiento limpio (24 mm x 60 mm, #1.5) cubreobjetos con mPEG y biotina-PEG-silano

NOTA: Este protocolo utiliza específicamente un sistema de biotina-estreptavidina para posicionar la actina y los microtúbulos dentro del plano de imagen TIRF. Se pueden utilizar otros recubrimientos y sistemas (por ejemplo, anticuerpos, poli-L-lisina, miosina NEM, etc.).

1. Descongele las alícuotas de los polvos de PEG-silano y biotina-PEG-silano.
2. Disuelva los polvos de PEG en etanol al 80% (pH 2.0) para generar soluciones madre de recubrimiento de 10 mg/mL de mPEG-silano y 2-4 mg/mL de biotina-PEG-silano, justo antes del uso.
   nota: Los polvos de PEG a menudo parecen disueltos, pero pueden no estar a nivel microscópico. La resuspensión adecuada tarda ~ 1-2 min con pipeteo constante. Se recomienda a los usuarios pipetear 10 veces más después de la aparición de la disolución del polvo.
   cautela: Use guantes para proteger la piel del HCl concentrado cuando haga etanol al 80% (pH 2.0).
3. Retire el cubreobjetos limpio (24 mm x 60 mm, #1.5) del almacenamiento de etanol con pinzas. Secar con gas nitrógeno y almacenar en una placa de Petri limpia.
4. Cubra los cubreobjetos con 100 μL de solución de recubrimiento: una mezcla de 2 mg/mL de mPEG-silano (MW 2.000) y 0,04 mg/mL de biotina-PEG-silano (MW 3.400) en etanol al 80% (pH 2,0).
   nota: Para un recubrimiento escaso (recomendado) use 2 mg/mL de mPEG-silano y 0,04 mg/mL de biotina-PEG-silano. Para recubrimientos densos, use 2 mg/mL de mPEG-silano, 4 mg/mL de biotina-PEG-silano.
5. Incubar los cubreobjetos a 70 °C durante al menos 18 h o hasta su uso.
   nota: Los cubreobjetos recubiertos se degradan si se almacenan a 70 °C durante más de 2 semanas.

>3. Montaje de cámaras de flujo de imágenes

1. Corte 12 tiras de cinta adhesiva de doble cara a una longitud de 24 mm. Retire un lado del soporte de la cinta y fije los trozos de cinta adyacentes a las seis ranuras presentes en una cámara de imagen limpia.
   nota: La cinta debe estar plana para un ensamblaje adecuado, de lo contrario, las cámaras de imágenes tendrán fugas. Retire con cuidado el respaldo de la cinta para evitar golpes. Se recomienda deslizar las cámaras con cinta sobre una superficie limpia para suavizar los contactos de la cámara de cinta.
2. Retire el segundo trozo de cinta adhesiva para exponer el lado adhesivo de la cinta a lo largo de cada ranura de la cámara. Coloque la cinta de la cámara con la cinta hacia arriba sobre una superficie limpia.
3. Mezcle la resina epoxi y las soluciones endurecedoras 1:1 (o de acuerdo con las instrucciones del fabricante) en un bote de pesaje pequeño.
4. Utilice una punta P1000 para colocar una gota de epoxi mezclado entre las tiras de cinta en el extremo de cada ranura de la cámara de imagen (flecha roja; Figura 1A). Coloque la cinta de la cámara / con el lado epoxi hacia arriba sobre una superficie limpia.
5. Retire un cubreobjetos recubierto de la incubadora a 70 °C. Enjuague seis veces las superficies revestidas y no recubiertas de los cubreobjetos con ddH₂O, séquelas con gas nitrógeno filtrado y, a continuación, péguelas a la cámara de imágenes con el lado del recubrimiento del cubreobjetos hacia la cinta.
6. Utilice una punta de pipeta P200 o P1000 para aplicar presión sobre la interfaz cinta-vidrio para garantizar un buen sellado entre la cinta y el cubreobjetos.
   nota: Con un sellado adecuado, la cinta adhesiva de doble cara se vuelve translúcida. Las cámaras de imagen que carecen de suficientes contactos de cámara de cinta tendrán fugas.
7. Incube las cámaras ensambladas a temperatura ambiente durante al menos 5-10 minutos para permitir que el epoxi selle completamente los pozos de la cámara antes de usarlo. Las cámaras de perfusión caducan a las 12-18 h del montaje.
   nota: Dependiendo de la colocación de la cinta y del grosor de la cinta de doble cara utilizada, la cámara ensamblada tendrá un volumen final de 20-50 μL.

>4. Acondicionamiento de cámaras de perfusión

1. Utilice una bomba de perfusión (velocidad ajustada a 500 μL/min) para intercambiar secuencialmente las soluciones acondicionadoras en la cámara de perfusión de la siguiente manera:
   1. Flujo de 50 μL de BSA al 1% para cebar la cámara de imagen. Retire el exceso de tampón del depósito del accesorio Luer-lock.
   2. Flujo de 50 μL de 0,005 mg/mL de estreptavidina. Incubar durante 1-2 minutos a temperatura ambiente. Retire el exceso de tampón del depósito.
   3. Caudal de 50 μL de BSA al 1% para bloquear la unión inespecífica. Incubar durante 10-30 s. Retire el exceso de tampón del depósito.
   4. Caudal 50 μL de tampón tibio (37 °C) 1x TIRF (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM de glucosa, 0,25% (v/v) de metilcelulosa (4.000 cp)).
      nota: No retire el exceso de tampón del depósito. Esto evita que la cámara se seque, lo que puede introducir burbujas de aire en el sistema.
   5. Opcional: Flujo de 50 μL de semillas de microtúbulos estabilizadas y 50% biotiniladas diluidas en 1x tampón TIRF.
      nota: La dilución adecuada debe determinarse empíricamente y contener la variabilidad de un lote a otro. Una dilución que produzca de 10 a 30 semillas por campo de visión funciona bien con esta configuración.

5. Preparación del microscopio

NOTA: Las reacciones bioquímicas que contienen filamentos dinámicos de actina y microtúbulos se visualizan/realizan utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total invertida (TIRF) equipado con láseres de estado sólido de 120-150 mW, un objetivo TIRF de inmersión en aceite de 63x corregido por temperatura y una cámara EMCCD. Las proteínas de este ejemplo se visualizan en las siguientes longitudes de onda: 488 nm (microtúbulos) y 647 nm (actina).

1. Configure el dispositivo de calentamiento de etapa/objetivo para mantener 35-37 °C al menos 30 minutos antes de obtener imágenes de la primera reacción bioquímica.
2. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes de la siguiente manera:
   1. Ajuste el intervalo de adquisición cada 5 s durante 15-20 min.
   2. Ajuste las exposiciones láser 488 y 647 a 50-100 ms a una potencia del 5%-10%. Establezca el ángulo TIRF apropiado para el microscopio.
      nota: Independientemente de la configuración del microscopio, la forma más sencilla de establecer la potencia del láser, la exposición y el ángulo TIRF es realizar ajustes en las imágenes de cualquiera de los polímeros solos (consulte 5.2.2.1 y 5.2.2.2, a continuación). Se recomienda encarecidamente a los usuarios que utilicen los ajustes de exposición y potencia láser más bajos que aún permitan la detección.
      1. Ajuste la reacción de polimerización (Figura 1C) para iniciar el ensamblaje del filamento de actina y adquirir imágenes a 647 nm. Realice los ajustes adecuados.
      2. Ajuste la reacción de polimerización en un segundo pocillo de perfusión condicionada para iniciar el ensamblaje de microtúbulos (Figura 1C) y visualice a 488 nm. Realice los ajustes adecuados.

>6. Preparación de mezclas de reacción proteica

1. Prepare una solución madre de tubulina marcada con fluorescencia.
   1. Determine la concentración de tubulina casera no marcada mediante espectrofotometría en Abs₂₈₀, de la siguiente manera:
      1. Espectrofotómetro en blanco con 1xBRB80 sin GTP.
      2. Calcular la concentración de tubulina utilizando el coeficiente de extinción determinado de 115.000 M^‐1 cm^‐1 y la siguiente fórmula:
         
   2. Resuspenda la 488-tubulina marcada con lisina liofilizada fabricada comercialmente a 10 μM (1 mg/mL; 100% de la etiqueta) con 20 μL de 1x BRB80 sin GTP.
   3. Descongele una alícuota de 7,2 μL de 100 μM de tubulina reciclada sin etiquetar sobre hielo.
      nota: La tubulina reciclada es fundamental para el ensamblaje exitoso de los microtúbulos in vitro, ya que elimina los dímeros incompetentes de polimerización formados en las reservas de proteínas congeladas.
   4. Combine 3 μL de 10 μM de 488-tubulina con la alícuota de 7,2 μL de 100 μM de tubulina sin marcar, no más de 15 minutos antes de usar.
2. Prepare la solución madre de actina marcada con fluorescencia.
   1. En el caso de las proteínas caseras, determine la concentración y el porcentaje de marcaje de actina mediante espectrofotometría AbsAbs₂₉₀ y Abs₆₅₀, de la siguiente manera:
      1. Espectrofotómetro en blanco con tampón G.
      2. Calcular la concentración de actina no marcada utilizando el coeficiente de extinción determinado de 25.974 M^‐1 cm^‐1 y la siguiente fórmula:
         
      3. Calcule la concentración de lisina marcada con Alexa-647-actina utilizando el coeficiente de extinción de la actina no marcada, el factor de corrección de flúor de 0,03 y la siguiente fórmula:
         
      4. Calcule la etiqueta de porcentaje de Alexa-647-actina utilizando el ε determinado para Alexa-647 de 239.000 M^‐1 cm^‐1, de la siguiente manera:
         
   2. Descongele una alícuota de 2 μL de 3 μM de actina de biotina 100% marcada (marcada en residuos de lisina). Diluir 10 veces añadiendo 18 μL de tampón G.
   3. Combine 3 μL de actina biotinilada diluida y volúmenes apropiados de actina no marcada y marcada (arriba) de modo que la mezcla final sea de 12,5 μM de actina total con 10%-30% de marcaje fluorescente.
      nota: Más del 30% de monómeros de actina fluorescentes (finales) pueden comprometer la resolución de la imagen, ya que los filamentos se vuelven difíciles de distinguir del fondo.
3. Prepare las mezclas de reacción (Figura 1C).
   1. Preparar la mezcla de citoesqueleto (tubo A) combinando 2 μl de la mezcla de actina de 12,5 μM (6.2.3) con la mezcla de masa de tubulina (6.1.4), no más de 15 minutos antes de la toma de imágenes. Almacene en hielo hasta su uso.
   2. Prepare la mezcla de reacción de proteínas (tubo B) combinando todos los demás componentes experimentales y proteínas, incluidos 2 tampones TIRF, antiblanqueador, nucleótidos, tampones y proteínas accesorias. Un ejemplo se muestra en la Figura 1C.
      nota: La dilución final da como resultado un tampón TIRF 1x que contiene ATP, GTP y fuerza iónica dentro del rango fisiológico estimado.
4. Incubar el tubo A y el tubo B por separado a 37 °C durante 30-60 s. Para iniciar la reacción, mezcle y agregue el contenido del tubo B al tubo A (abajo).

>7. Dinámica de actina y microtúbulos de la imagen

1. Acondicione el pozo de perfusión (Figura 1B; paso 4, arriba).
2. Inicie el ensamblaje de actina y microtúbulos simultáneamente agregando el contenido del tubo B (mezcla de reacción) al tubo A (mezcla de citoesqueleto) (Figura 1C).
3. Flujo de 50 μL de la reacción que contiene 1x tampón TIRF suplementado con 15 μM de tubulina libre, 1 mM de GTP y 0,5 μM de monómeros de actina y volúmenes apropiados de controles de tampón.
4. Grabe vídeos time-lapse utilizando un software de microscopio para adquirirlos cada 5 s durante 15-20 min.
   nota: El inicio de la dinámica de actina y microtúbulos se produce en 2-5 minutos (Figura 2). Los retrasos más largos indican problemas con el control de la temperatura o problemas relacionados con la concentración de proteínas en la mezcla de reacción.
5. Acondicione un nuevo pocillo de perfusión (paso 4) y reemplace el volumen del tampón con la(s) proteína(s) reguladora(s) de interés (es decir, Tau) y controles de tampón (Figura 1C). Adquiera como se describe en el paso 7 (arriba) para evaluar las proteínas reguladoras de las funciones emergentes de actina-microtúbulos.

Resultados

Figura 1. Esquemas experimentales: montaje de la cámara de flujo para la adquisición de imágenes. (A) Montaje de la cámara de imágenes. De arriba a abajo: las cámaras de imágenes IBIDI están pegadas con cinta adhesiva a lo largo de los pocillos de perfusión (indicados con una flecha); se retira la segunda capa (blanca) de cinta adhesiva (que se deja en la imagen que se muestra para orientar mejor a los usuarios) y s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1% BSA (c/v)	Fisher Científico	BP1600-100	Para este propósito (bloqueo de cámaras TIRF), BSA se resuspende en ddH20 y se filtra a través de un filtro de 0,22 μm.
1× BRB80	casero		80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 con KOH
80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 con KOH	Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO	G2133-50KU	Combinado con catalasa, alícuota y almacenar a -80 oC hasta su uso
100 μM de tubulina	Citoesqueleto Inc., Denver, CO	T240	Las tubulinas caseras deben reciclarse antes de su uso para eliminar la tubulina incompetente de polimerización (Hyman et al. (1992)29; Li y Moore (2020)30 ). Las tubulinas disponibles en el mercado suelen estar demasiado diluidas para reciclarlas, pero funcionan bien si se resuspenden de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se aclaran previamente mediante ultracentrifugación (278.000 × g) durante 60 minutos, antes de su uso.
100 mM de ATP	Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO	A-08	Resuspendido en ddH20 (pH 7,5) y esterilizado por filtro.
100 mM GTP	Fisher Científico	AC226250010	Resuspendido en 1× BRB80 (pH 6,8) y esterilizado con filtro.
Láseres de estado sólido de 120-150 mW	Microsistemas Leica	11889151; 11889148
2 mg/mL de catalasa	Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO	C40-100	Combinado con glucosa oxidasa, alícuota y almacenar a -80 oC hasta su uso
2× Búfer TIRF	Loco en casa		2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM de glucosa, 0,5% (v/v) de metilcelulosa (4.000 cp); Nota: 1 μL de 0,1M de GTP y 1 μL de 0,1M de ATP añadidos por separado a las reacciones TIRF para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
24 × 60 mm, cubreobjetos #1.5	Fisher Scientific, Waltham, MA	22-266882	El cubreobjetos debe lavarse exhaustivamente antes de su uso (Smith et al. (2014)22 )
Bloque térmico de 37 oC
Baño de agua a 37 oC
5 mg/mL de estreptavidina (600x stock)	Avantor, Filadelfia, PA	RLS000-01	Resuspendido en Tris-HCl (pH 8,8); diluir la alícuota al 1× en tampón HEK el día de uso
5 min Resina epoxi y endurecedor	Loctite, Rocky Hill, CT	1365736	La combinación de resina y endurecedor puede tardar hasta 30 minutos en curarse.
50% de semillas de microtúbulos biotiniladas-GpCpp	Citoesqueleto Inc; Casero	T333P	(opcional) Las semillas de microtúbulos estabilizadas con GppCpp o Taxol pueden mediar de manera más eficiente la polimerización de microtúbulos. Taxol y GppCpp estabilizan los microtúbulos de diferentes maneras que pueden afectar la estructura de la red de microtúbulos y la capacidad de ciertas proteínas reguladoras para unirse a la parte estabilizada del microtúbulo. Un método para hacer diversos tipos de semillas de microtúbulos se describe en Hyman et al. (1992).
Incubadora de 70 C
Stock de mezcla de actina	Hecho en casa; este protocolo		Una mezcla de actina de 12,5 μM compuesta por actina marcada (fluorescente y biotinilada) y no marcada para un máximo de seis reacciones. Se utilizan 2 μL de caldo en la reacción TIRF final. La concentración final de actina utilizada en cada reacción es de 0,5 μM (10% con Alexa-647; 0,09% con biotina).
Controles de búfer adecuados	casero		Combinación de tampones de todas las proteínas que se están evaluando
Biotina-PEG-silano (MW 3.400)	Laysan Bio Inc	biotina-PEG-SIL-3400	Se dispensa en alícuotas de 2-5 mg, se rellena con nitrógeno, se cierra con parafilm y se almacena a -20 C con desecante hasta su uso
Actina biotinilada	Citoesqueleto Inc; Casero	AB07	La biotina-actina se fabrica mediante el marcaje en los residuos de lisina y, por lo tanto, se supone que está al menos 100% marcada, pero varía según los diferentes lotes/preparaciones. Las concentraciones óptimas de actina biotinilada deben determinarse empíricamente para usos particulares/diseños experimentales. Las concentraciones más altas permiten un seguimiento más eficiente, pero pueden impedir la polimerización o las interacciones con las proteínas reguladoras. Aquí, un pequeño porcentaje (0,09% o 900 pM) de actina biotinilada está presente en la reacción TIRF final.
Detergente	Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH		Por razones desconocidas, la versión azul limpia los cubreobjetos de manera más eficiente que otros colores disponibles.
hielo seco
Actina marcada con fluorescencia	Citoesqueleto Inc; Casero	AR05	La actina casera marcada con fluorescencia se almacena en un tampón G suplementado con 50% de glicerol a -20 C (Spudich et al. (1971) 47; Liu et al. (2022)48 ). La actina marcada con fluorescencia se dializa contra el tampón G y se aclara previamente mediante ultracentrifugación durante 60 minutos a 278.000 × g antes de su uso.
Tubulina marcada con fluorescencia	Citoesqueleto Inc	TL488M, TLA590M, TL670M	Resuspendido en 20 μL 1× BRB80 (concentración final de 10 μM) y preaclarado mediante ultracentrifugación (278.000 × g) durante 60 min, antes de su uso.
Búfer G	casero		3 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM de CaCl2, 0,5 mM de TDT, 0,2 mM de ATP
Búfer HEK	casero		20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl
hielo
Cubitera
Cámara de imagen	IBIDI, Fitchburg, WI	80666	Pida cámaras sin fondo para utilizar diferentes recubrimientos de cubreobjetos
Cámara iXon Life 897 EMCCD	Andor, Belfast, Irlanda del Norte	8114137
Software de microscopio LASX Premium	Microsistemas Leica	8114137
Metilcelulosa (4.000 cp)	Sigma Aldrich Inc	M0512
Base de microscopio equipada con módulo TIRF	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania	11889146
mPEG-silano (MW 2.000)