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1. Realización de la alineación diaria de LLSM
NOTA: (Importante) Este protocolo de alineación se basa en el instrumento LLSM utilizado (ver la Tabla de Materiales). Cada LLSM puede ser diferente y requerir diferentes estrategias de alineación, especialmente aquellas que son construidas en casa. Lleve a cabo la alineación de rutina adecuada y continúe con la sección 2.
- Agregue 10 ml de agua más 30 μl de fluoresceína (1 mg/ml de caldo) al baño LLSM (~10 ml de volumen), presione Imagen (Inicio) para mover el objetivo a la posición de la imagen y observe un solo patrón de rayo láser Bessel. Alinee el rayo láser utilizando las guías y la región de interés (ROI) preestablecida para hacer que el haz sea un patrón delgado equilibrado en todas las direcciones.
- El haz también debe aparecer enfocado en la cámara del buscador. Utilice dos ajustadores de inclinación del espejo, un micrómetro superior, un enfoque y un collar de objetivo de emisión para ajustar. Consulte la Figura 1 A y B para ver el haz alineado correctamente.
- Lave el baño y los objetivos con al menos 200 ml de agua para eliminar completamente la fluoresceína.
- Imagen de perlas fluorescentes estándar en los medios de imagen (preparadas adhiriendo perlas a un cubreobjetos de 5 mm con poli-L-lisina, consulte la Tabla de Materiales; esto se puede preparar previamente y reutilizar) para la función de dispersión de punto físico (PSF) en medios de imagen.
NOTA: Solo puede haber una cuenta a la vista para su posterior procesamiento, así que intente encontrar una cuenta que esté sola en el visor o que se pueda recortar fácilmente para obtener una sola cuenta.
- Encienda el tramado configurándolo en 3 en el cuadro 'Rango X Galvo'. Presione En vivo para ver el campo actual. Muévete a lo largo de la dirección Z para encontrar el cubreobjetos y las cuentas. Encuentre el centro de una cuenta moviéndose a lo largo de Z, presione Stop para pausar el láser. Compruebe 3D, pulse Centro y, a continuación, pulse Ejecutar. Esto recopilará los datos.
- Ajuste manualmente el espejo de inclinación, el collar del objetivo y el micrómetro de enfoque para obtener los valores de gris más altos, luego ajuste según sea necesario para obtener los patrones adecuados para los modos de captura de escaneo de objetivo, z galvo, z+objetivo (totPSF) y escaneo de muestra (samplePSF). Consulte la Figura 1 C-F para ver las proyecciones de intensidad máxima (MIP) correctamente ajustadas.
nota: Los distintos modos de captura (escaneo de objetivo, z galvo, z+objetivo y escaneo de muestra) cambian la forma en que la hoja de luz se mueve a través de la muestra. Se deben utilizar todos los modos de escaneo para la alineación.
- El escaneo de muestra muestra cómo se recopilarán los datos durante el experimento. Recoja la PSF de muestra pulsando Ejecutar en el modo de escaneo de muestra para la desviación y la deconvolución. Cambie los láseres a tres modos de color (488, 560, 647) y presione Ejecutar nuevamente.
nota: Dado que las imágenes LLSM están en un ángulo (57,2°), las imágenes capturadas en el modo de "escaneo de muestra" se recopilan en este ángulo y, por lo tanto, están "sesgadas". El desesgo, es el proceso de corregir este ángulo y "realinear" la imagen a una verdadera pila z. Estos datos deben recogerse en medios de imagen y en todos los canales que se visualizarán durante el experimento. Si esto no se recopila correctamente, los datos no se desviarán correctamente. Del mismo modo, asegúrese de que el medio se haya calentado a 37 °C (o a la temperatura experimental deseada).
>2. Configuración de celdas con LLSM
- Agregue 100,000 células presentadoras de antígenos (APC) (50 μL) a un cubreobjetos circular de 5 mm de diámetro y déjelas reposar durante 10 minutos.
- Engrase el portamuestras y luego agréguele el cubreobjetos con el lado de la celda hacia arriba. Agregue una gota de medio de imagen en la parte posterior del cubreobjetos para evitar burbujas antes de colocarlo en el baño. Enrosque el portamuestras en el piezoeléctrico y pulse Imagen (Inicio).
- Encuentre un APC a imagen para asegurarse de que el LLSM y el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales) funcionen correctamente.
nota: Tomamos imágenes con un tamaño de paso de 0,4 μm con 60 pasos z y una exposición de 10 ms para dos colores con un tramado establecido en 3, lo que da como resultado 1,54 s por fotograma de la imagen 3D con una resolución XY de ~200 nm y Z de 400 nm. Es posible que sea necesario ajustar estos ajustes en función del tamaño de la célula, la resolución z deseada y la intensidad de la señal de la técnica de etiquetado fluorescente utilizada. El uso de la energía del láser también variará según la técnica de etiquetado fluorescente utilizada.
- Pulse Live para ver la imagen actual. Muévete a lo largo de Z para encontrar el cubreobjetos y las celdas.
- Encuentre el centro de un APC moviéndose en la dirección Z y, a continuación, pulse Detener para pausar el láser. Marque 3D e ingrese la configuración deseada, presione Centro y luego presione Ejecutar. Esto recopilará los datos.
- Baje la platina hasta la posición de carga y añada 50 μL de células T en el medio de imagen (100.000 células) gota a gota directamente sobre el cubreobjetos. Lo mejor es dejar que se forme una gota en el extremo de la punta de la pipeta y luego tocar el líquido del baño con la punta. Levanta el escenario hacia atrás haciendo clic en "Imagen (Retorno)".
- Comience a tomar imágenes. Asegúrese de establecer el tamaño de pila deseado y la longitud del lapso de tiempo. Por ejemplo, imagine 60 pilas z con un tamaño de paso de 0,4 μm y entrada de 500 fotogramas de tiempo. (Normalmente) detenga la grabación antes de alcanzar los 500 fotogramas para evitar el fotoblanqueo. Utilice el modo En vivo para buscar pares de celdas y, cuando se hayan ingresado las configuraciones listas y deseadas, presione Ejecutar para recopilar datos. Consulte la Figura 2 para ver un ejemplo.
