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1. Preparación del portaobjetos del microscopio
NOTA: Las células U87 MG de tercera a décima generación con alta actividad se utilizan en experimentos SPT.
- Esterilizar cubreobjetos de 22 mm × 22 mm ya limpios con solución de Piraña sumergiéndolos en etanol (99,9%).
- Use pinzas para sacar el cubreobjetos de la solución de etanol (paso 1.1) y esterilicelo quemando etanol en la llama. Una vez que se haya quemado todo el etanol, coloque las cubreobjetos en una placa de plástico de cultivo celular (35 x 10 mm) llena con 2 mL de medio celular (sin rojo fenol).
- Agregue 50 μL de la suspensión de celdas en el cubreobjetos y empuje suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás y hacia la izquierda y la derecha para distribuir uniformemente las celdas. Colócalo en un ambiente humidificado.
- Cuando las células U87 MG en el cubreobjetos alcancen una confluencia del 20%-40% (~12 h), agregue 20 μL de CTAB-AuNR (nanovarillas de oro sintetizadas con la molécula de bromuro de amonio cetiltrimetilamonio como agente protector, 138 pM) en el plato y disperse. Incubar en una atmósfera humidificada durante 5 min.
- Agregue 100 μL del medio de cultivo (sin rojo de fenol) del plato en el paso 1.4 en la ranura del portaobjetos de vidrio ranurado (Figura 1) que se limpia previamente con solución de piraña.
- Saque el cubreobjetos del plato e inviértalo en la parte superior de la ranura del portaobjetos de vidrio del microscopio (Figura 1). Séllalo con esmalte de uñas, déjalo secar y colócalo en el escenario para realizar experimentos SPT.
>2. Realización de experimentos de seguimiento de partículas individuales con microscopía de campo oscuro (Figura 1).
- Coloque una gota de aceite en el condensador de campo oscuro sumergido en aceite (apertura numérica [NA] 1.43-1.20) y gire la perilla para que el condensador entre en contacto con el vidrio se deslize.
- Coloque una gota de aceite en la parte superior de la cubierta de vidrio y gire la perilla de enfoque para que el objetivo de inmersión en aceite 60x (NA 0.7–1.25) toque el aceite.
- Encienda la fuente de luz y gire ligeramente la perilla de enfoque para enfocar el plano de imagen.
nota: En el campo de visión, el fondo es negro, las celdas son brillantes y los CTAB-AuNR (relación de aspecto ~ 2: 1, Figura 2) son pequeños puntos de dispersión de color (rojo, amarillo o verde).
- Capture la luz dispersa de la muestra con una cámara CMOS en color. Haga clic en el "Icono de la cámara" en el software para grabar y exportar el formato TIFF para guardar las imágenes.
3. Adquisición de datos
- Extraiga una única trayectoria a largo plazo
- Opere como se describe en la Figura 3 para convertir las imágenes de campo oscuro de series temporales del modo "Color RGB" al modo "8 bits". En la Imagen J, haga clic en Imagen | Tipo | 8 bits. Para ajustar el contraste, haga clic en Imagen | Ajustar | Brillo | Contraste.
- Seleccione una partícula objetivo y corte los fondos de las series temporales boxeando y eliminando el fondo con "Ctrl+X".
- Abra la ventana de detección de partículas y enlace de partículas haciendo clic en el botón "Plugins | Rastreador de partículas clásico | Rastreador de partículas".
- Establezca Radio en 6, Corte en 0 y Percentil en 0.01%.
nota: Para detectar la partícula, ajuste los tres parámetros anteriores con la ayuda de Vista previa. Asegúrese de que el radio sea ligeramente mayor que la partícula objetivo y menor que la separación entre partículas más pequeña. El percentil es el límite inferior de la distribución de intensidad que son las partículas candidatas.
- Establezca el Rango de enlace en 5 y el Desplazamiento en 10.
nota: Para vincular la partícula entre fotogramas adyacentes consecutivos, ajuste los dos parámetros anteriores. El desplazamiento es el número máximo de píxeles que una partícula puede moverse entre dos fotogramas sucesivos, y el rango de enlace es el número de fotogramas consecutivos que se deben tener en cuenta a la hora de determinar la mejor coincidencia correspondiente.
- Haga clic en "Aceptar" para abrir la ventana de resultados de ParticleTracker y ver los resultados.
- Haga clic en "Visualizar todas las trayectorias" para inspeccionar las trayectorias generadas.
- Haga clic en el menú "Revincular partículas" en la parte superior para volver a vincular las partículas detectadas con diferentes rangos de enlace y parámetros de percentil, si la trayectoria generada por el software no coincide con la trayectoria en movimiento del AuNR.
- Haga clic en "Guardar informe completo" para guardar los resultados si la trayectoria generada por el software y la trayectoria móvil del AuNR coinciden.
NOTA: En la Figura 4 se muestra un ejemplo de extracción de una sola trayectoria a largo plazo con la Imagen J.
