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1. Modificación del microscopio y lente del objetivo
- Inserte un espejo 50/50 en la rueda de filtros del microscopio fluorescente utilizando un cubo de filtro adecuado (Figura 1). Manipule el espejo 50/50 con cuidado, ya que a menudo tienen un revestimiento antirreflectante.
nota: Utilizamos un espejo 50/50 en un cubo de filtro vacío del microscopio. El espejo 50/50 se inserta donde se encuentra el espejo dicroico.
- Utilice un objetivo de aceite de alta ampliación/alta apertura numérica (NA).
nota: En este protocolo, utilizamos un objetivo 100x/1.3 NA.
>2. Preparación de la cámara para adherir los microtúbulos a la superficie
- Limpie los portaobjetos de microscopio y los cubreobjetos de 22 mm x 22 mm (para microscopios verticales) o los cubreobjetos de 22 mm x 22 mm y 18 mm x 18 mm (para microscopios invertidos). Modifique la superficie según sea necesario. Por ejemplo, limpie los cubreobjetos con un detergente alcalino (consulte la Tabla de materiales) seguido de etanol al 100% con lavados con agua destilada entre y después.
- Corte tiras de 3 mm de ancho de película plástica de parafina (ver Tabla de Materiales) usando una cuchilla de afeitar y otro portaobjetos de microscopio como borde.
- Coloque dos tiras de película plástica de parafina a 3 mm de distancia en un cubreobjetos limpio de 22 x 22 mm. A continuación, coloque un cubreobjetos de 18 mm x 18 mm para formar un canal. Si usa un microscopio vertical, coloque las tiras encima de un portaobjetos de microscopio limpio y luego coloque un cubreobjetos encima.
- Coloque el cubreobjetos (o portaobjetos) en un bloque de calor a 100 °C durante 10-30 s para que la película de parafina forme un canal sellado.
- Flujo en 50 μg/mL de anticuerpo (en Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) por perfusión utilizando una pipeta. Incubar durante 10 min.
nota: Utilizamos anticuerpos anti-rodamina para unir las semillas de microtúbulos marcados con rodamina a la superficie. Alternativamente, la avidina se puede usar para unirse a semillas de microtúbulos marcados con biotina o a partículas de oro biotiniladas. Para observar simplemente los microtúbulos en ausencia de tubulina en solución (es decir, un ensayo no dinámico), se puede utilizar un anticuerpo anti-tubulina.
- Lavar cinco veces con tampón BRB80. Se recomienda filtrar las soluciones con un filtro de 0,22 μm.
- Flujo en poloxamer 407 al 1% (un copolímero tribloque) en BRB80 para bloquear la superficie contra la unión no específica. Incubar durante 10 min.
- Lavar cinco veces con tampón BRB80.
- La muestra está lista para ser colocada en el microscopio. Para evitar que la muestra se seque, agregue dos gotas de tampón BRB80 en los extremos del canal y reponga cuando sea necesario.
3. Alineación del microscopio
- Coloque la muestra en la platina del microscopio. Encienda la fuente de luz de epi-iluminación.
- Concéntrese en la superficie de la muestra. Observará múltiples superficies a medida que el objetivo se mueve hacia arriba y hacia abajo debido a la reflexión posterior de la luz de la óptica dentro de la trayectoria óptica. Un buen método para encontrar la superficie de la muestra es enfocarse en el borde de la película de parafina. Una vez que se encuentre la superficie, establezca el campo de visión en el centro de la cámara.
- Centre el diafragma de campo en el campo de visión cerrándolo hasta la mitad y utilizando los tornillos de ajuste. Una vez alineado, vuelva a abrir el diafragma.
nota: El ajuste de los tornillos solo debe realizarse esporádicamente, tal vez cada 3-6 meses o cuando se solucionan problemas.
- Deslice la lente Bertrand para ver la pupila de salida (plano focal posterior) del objetivo.
- Cierre el diafragma de apertura (AD) más allá de los bordes de la pupila de salida del objetivo.
- Utilice los tornillos de ajuste para centrar el AD con la pupila de salida. Vuelva a comprobarlo abriendo el AD y haciendo coincidir sus bordes con los de la pupila de salida.
nota: Este ajuste solo debe realizarse esporádicamente.
- Ajuste el diafragma de apertura a aproximadamente 2/3 de la NA del objetivo.
>4. Imagen de microtúbulos estabilizados o partículas de oro de 40 nm
NOTA: Los microtúbulos estabilizados y las nanopartículas de oro sirven como buenas muestras de control. Se recomienda obtener imágenes de microtúbulos adheridos a la superficie o nanopartículas de oro como primer paso para evaluar el rendimiento de IRM y ayudar a establecer la apertura óptima del diafragma (sección 7).
- Establezca el tiempo de exposición de la cámara en 10 ms y ajuste la iluminación para casi saturar el rango dinámico de la cámara.
- Flujo en 10 μL de microtúbulos estabilizados con guanilil-(alfa, beta)-metileno-difosfonato (GMPCCP) o taxol en BRB80 (o partículas de oro de 40 nm) por perfusión con una pipeta a una muestra fresca y controlar la unión mediante imágenes de la superficie. Una vez que se unan entre 10 y 20 microtúbulos dentro del campo de visión, lave la muestra 2 veces con BRB80.
nota: Con un microscopio bien alineado, los microtúbulos deben ser visibles sin sustracción de fondo.
- Adquiera 10 imágenes configurando un lapso de tiempo con un período de retardo de 1 segundo durante 10 segundos (con una exposición de 10 ms).
- Adquirir una imagen de fondo. Para hacerlo, mueva el escenario usando el controlador de escenario o el software de la computadora a lo largo del eje de largo del canal mientras adquiere 100 imágenes sin demora (es decir, transmitiendo cerca de 100 fps @ 10 ms de exposición).
nota: El fondo es la mediana de las 100 imágenes. Al tomar la mediana, el perfil de iluminación y otras características estacionarias como la suciedad en la óptica se conservan mientras que todo lo demás se filtra. No debe haber inclinación en la muestra, ya que esto provocará un cambio en la posición axial a medida que se mueve la plataforma y, en última instancia, degradará la imagen de fondo. Si no se puede evitar la inclinación, entonces un método alternativo es adquirir imágenes de fondo promediadas antes de que fluyan las semillas.
- Para procesar y analizar las imágenes, vaya al paso 6.
5. Imagen de la dinámica de los microtúbulos
- Para la dinámica de microtúbulos utilizando tubulina cerebral, ajuste la temperatura del calentador de muestras a 37 °C.
- Fluya 10 μL de semillas de microtúbulos estabilizadas con GMPCCP en BRB80 por perfusión con una pipeta a una muestra fresca y controle su unión a la superficie mediante imágenes de la superficie en vivo (es decir, mientras se transmite). Una vez que 10-20 semillas estén unidas con el campo de visión, lave la muestra usando un volumen de canal 2x con BRB80 (BRB80 debe precalentarse a 37 °C o al menos a temperatura ambiente).
nota: Con un microscopio bien alineado, las semillas deben ser visibles sin sustracciones de fondo.
- Flujo en la mezcla de polimerización (7,5 μM de tubulina no marcada + 1 mM de trifosfato de guanosina (GTP) + 1 mM de ditiotreitol (DTT) en tampón BRB80). Para medir el crecimiento de los microtúbulos, establezca un lapso de tiempo utilizando el software de adquisición para adquirir una imagen cada 5 segundos (0,2 fotogramas por segundo [fps]) durante 15 minutos.
- Para mejorar el contraste, adquiera 10 imágenes (en lugar de una) en cada punto de tiempo y promedie su promedio. Para la contracción de microtúbulos, adquiera imágenes a 100 fps ajustando el retardo de tiempo a 0 y un tiempo de exposición de 10 ms (es posible un fps más alto con regiones de interés más pequeñas dependiendo de la cámara utilizada).
- Adquiera una imagen de fondo como en el paso 4.4.
6. Procesamiento y análisis de imágenes
>NOTA: Para el análisis, este protocolo utiliza Fiji, pero el lector es libre de usar cualquier software que considere adecuado.
- Abre las imágenes de fondo guardadas.
- Calcule la imagen mediana (es decir, el fondo) utilizando Imagen > pila > proyecto Z > Mediana.
- Abra la película de dinámica de microtúbulos como una pila (lo mismo para los microtúbulos no dinámicos) usando Archivo > Abrir.
- Reste la imagen de fondo de la pila utilizando la calculadora de > de imágenes. Asegúrese de marcar la opción "Resultado de 32 bits (flotante)".
- En el caso de los microtúbulos dinámicos, con la herramienta de línea dibuje una línea a lo largo del microtúbulo de interés y añádala al administrador de regiones de interés pulsando "t". Repita el procedimiento para todos los microtúbulos de interés.
- En el caso de los microtúbulos dinámicos, ejecute la macro Multi-Kymo. La macro generará un video y un quimógrafo para cada microtúbulo en el administrador de ROI. Cada microtúbulo tendrá un identificador único.
- En el caso de los microtúbulos dinámicos, ejecute la macro Kymo-Analysis y siga sus pasos para medir las tasas de crecimiento y las tasas de contracción de los microtúbulos.
>7. Tamaño del diafragma de apertura
NOTA: Un factor importante para adquirir imágenes de alto contraste de microtúbulos utilizando IRM es ajustar correctamente la apertura numérica de iluminación (INA). El INA se puede cambiar cambiando el tamaño del haz de iluminación entrante en la pupila de salida del objetivo, que está controlado por el tamaño del AD (el AD se encuentra en un plano conjugado con la pupila de salida (plano focal posterior) del objetivo, Figura 1):
donde DAD es el diámetro del diafragma de apertura, fobjetivo es la distancia focal del objetivo y Dep es el diámetro de la pupila de salida del objetivo. Por lo general, el AD se deja completamente abierto para la obtención de imágenes de fluorescencia, por lo que el INA es igual al NA del objetivo. En un microscopio de fluorescencia, la escala AD no indica su diámetro, por lo que no se puede calcular el INA. Es posible calibrar el tamaño del AD con la ayuda de un objetivo. Sin embargo, no es necesario, ya que el tamaño del anuncio se fijaría en el tamaño que produce el mayor contraste.
- Prepare una muestra de microtúbulos estabilizados marcados con fluorescencia adheridos a la superficie (pasos 4.1-4.2).
nota: Se utilizaron microtúbulos marcados con tetrametilrodamina (Ex: 550 nm, Em: 580 nm).
- Enfocar los microtúbulos con la perilla de enfoque del microscopio mientras toma imágenes fluorescentes de los mismos (si los microtúbulos no están marcados, tome imágenes con IRM o DIC).
- Ajuste la exposición de la cámara a 10 ms utilizando el software de la cámara.
nota: Esta exposición es arbitraria y una exposición de 100 ms también funcionaría.
- Cierre el AD hasta su abertura más pequeña. Ajuste la iluminación para saturar casi el rango dinámico de la cámara o al máximo posible.
nota: Como guía, utilice la tabla de búsqueda que suele proporcionar el software de adquisición.
- Adquiera 10 imágenes (transmitiendo o tomando una imagen cada segundo) de un campo de visión que contiene 10+ microtúbulos.
- Adquiera una imagen de fondo como en el paso 4.4.
- Cambie el tamaño del AD y repita los pasos 7.5-7.6 para todo el rango de apertura del AD (desde el tamaño de la pupila cerrada hasta el tamaño de la pupila de salida, Figura 2). Cada vez que se cambie el tamaño del AD, ajuste la intensidad de la iluminación para que coincida con la del paso 7.4.
- Por cada campo de visión adquirido, reste el fondo correspondiente utilizando la calculadora de > de imágenes y eligiendo "restar" en el menú desplegable. Asegúrese de que la opción "Resultado de 32 bits (flotante)" esté marcada. A continuación, promedie las imágenes resultantes utilizando la pila de > imagen > el promedio > proyecto Z.
- Mida la relación señal-ruido de fondo (SBR) de los microtúbulos, definida como la intensidad media de la señal de microtúbulos (intensidad del microtúbulo menos la intensidad del fondo) dividida por la desviación estándar del fondo (Figura 3).
- Determine el tamaño óptimo de DA (es decir, el INA óptimo) calculando el SBR promedio de los microtúbulos para cada tamaño de abertura, y establezca el tamaño de AD en el que produzca el SBR más alto (Figura 2). Es posible que haya una gama de tamaños de AD que produzcan un contraste comparable.
