Microscopía de reflexión de interferencias para la visualización sin etiquetas de la dinámica de los microtúbulos

Abstract

Fuente: Mahamdeh, M., et al. Implementación de Microscopía de Reflexión de Interferencia para la Obtención de Imágenes de Microtúbulos sin Etiquetas y de Alta Velocidad. J. Vis. Exp. (2019).

En este video, describimos la técnica de microscopía de reflexión de interferencia (IRM) para visualizar microtúbulos que crecen en una superficie de cubreobjetos en presencia de un tampón adecuado. Al iluminarse con luz incidente, la interfaz cubreobjetos-tampón y la interfaz tampón-microtúbulos reflejan la luz, lo que se combina para crear un patrón de interferencia, lo que permite la visualización de los microtúbulos como imágenes de alto contraste sobre un fondo brillante.

Protocol

1. Modificación del microscopio y lente del objetivo

1. Inserte un espejo 50/50 en la rueda de filtros del microscopio fluorescente utilizando un cubo de filtro adecuado (Figura 1). Manipule el espejo 50/50 con cuidado, ya que a menudo tienen un revestimiento antirreflectante.
   nota: Utilizamos un espejo 50/50 en un cubo de filtro vacío del microscopio. El espejo 50/50 se inserta donde se encuentra el espejo dicroico.
2. Utilice un objetivo de aceite de alta ampliación/alta apertura numérica (NA).
   nota: En este protocolo, utilizamos un objetivo 100x/1.3 NA.

Results

Figura 1. Representación esquemática de IRM. (A) La epiiluminación de la fuente de luz pasa a través del diafragma de apertura antes de llegar al espejo 50/50. El diafragma de apertura establece el ancho del haz, por lo tanto, la iluminación NA. El espejo 50/50 refleja parcialmente la luz hasta el objetivo para iluminar la muestra. La luz reflejada de la muestra se recoge y luego se proyecta en el chip de la cámara (por la lente del.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscopio	Nikon	Ti-Eclipse	Un microscopio invertido utilizado para realizar los exprimentos
Divisor de haz 50/50	Chroma	Año 21000	Al comprar, asegúrese de elegir las dimensiones del divisor que se ajusten al cubo utilizado en el microscopio
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Objetivo de iris	Nikon	MRH02902	Objetivo de imagen. Este objetivo tiene un iris de ajuste NA que se abrió a NA 1.3
Detergente universal Mucasol	Sigma-Aldrich	Z637181-2L	Se utiliza para la limpieza de cubreobjetos y correderas
Película plástica de parafina (nombre comercial Parafilm M)	Sigma-Aldrich	Página 7793	Se utiliza para la construcción de canales de flujo
Anticuerpo anti-TAMRA	Invitrogen	A-6397	Se utiliza para unir moléculas marcadas con TAMRA (por ejemplo, microtúbulos) a la superficie de la muestra. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (nombre comercial Pluronic F-127)	Sigma-Aldrich		Se utiliza para bloquear la superficie del canal para evitar el enlace inespecífico
Nanopartículas de oro de 40 nm	Sigma-Aldrich	753637	Se utiliza como muestra de control
Nanopartículas de oro de 20 nm	Sigma-Aldrich	753610	Se utiliza como muestra de control
Cámara Zyla 4.2	Andor	Zyla 4.2	2048x2048 píxeles (tamaño de píxel de 6,5 μm) con eficiencia cuántica del 72% y rango dinámico de 16 bits
Software de seguimiento Feista			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
Microtúbulos estabilizados			Preparado internamente (ver referencias en el texto)