Microscopía estática de fuerza atómica para visualizar y caracterizar nucleosomas ensamblados

Resumen

Fuente: Stormberg, T., et al. Sondeo de la estructura y dinámica de los nucleosomas mediante imágenes de microscopía de fuerza atómica. J. Vis. Exp.(2019)

En este video, demostramos la microscopía estática de fuerza atómica para visualizar nucleosomas ensamblados. Esta técnica de imagen de alta resolución permite el estudio de la estructura del nucleosoma.

Protocolo

>1. Funcionalización de la superficie de mica para la obtención de imágenes AFM estáticas de nucleosomas

1. Prepare una solución madre de 1-(3-aminopropil) silatrena APS de 50 mM en agua desionizada como se describe. Almacene 1 mL de alícuotas de esta solución a 4 °C hasta su uso.
   nota: Las alícuotas pueden almacenarse durante más de un año a 4 °C.
2. Prepare una solución APS 1:300 de trabajo para la modificación de mica disolviendo 50 μL del stock de APS de 50 mM en 15 mL dd_{H 2}O.
   nota: Esta solución de trabajo se puede almacenar a temperatura ambiente durante varios días.
3. Corte tiras de mica de 1 x 3 cm de láminas de mica de alta calidad (consulte la Tabla de materiales para la mica utilizada aquí).
   1. Compruebe que la pieza encaja cuando se coloca en diagonal en una cubeta. Use la punta de unas pinzas afiladas, una hoja de afeitar o cinta adhesiva para cortar capas de mica hasta que ambos lados estén recién cortados y la pieza sea tan delgada como ~ 0.1 mm (Figura 1A). Coloque inmediatamente la pieza de mica en la cubeta llena de APS e incube durante 30 minutos (Figura 1B).
4. Transfiera el trozo de mica a una cubeta llena de dd H2O y remoje durante 30 s (Figura 1C). Seque completamente ambos lados de la tira de mica APS bajo un flujo de argón.
   nota: Se puede usar una toallita no tejida de celulosa y poliéster para salas limpias (se recomienda una toallita detallada en los materiales) para ayudar a absorber el agua del borde de la mica durante el secado.
5. Utilice la tira de mica seca ahora para la preparación de la muestra. De lo contrario, guarde la pieza en una cubeta limpia y seca (Figura 1D).
   nota: Se recomienda un almacenamiento adicional en el vacío durante 1-2 h cuando el ambiente es húmedo. El protocolo se puede pausar aquí.

>2. Preparación de muestras de nucleosomas en APS-Mica para imágenes de AFM estáticas

1. Aplique cinta adhesiva de doble cara a varios discos magnéticos y colóquelos a un lado.
2. Corte el sustrato de mica APS al tamaño deseado (cuadrados de 1 x 1 cm para el instrumento MM AFM utilizado aquí). Coloque estas piezas en una placa de Petri limpia y manténgalas cubiertas.
3. Prepare tres diluciones de los nucleosomas ensamblados (concentraciones finales de nucleosomas de 0,5, 1,0 y 2,0 nM) utilizando un tampón filtrado de 0,22 μm que contenga 10 mM HEPES pH 7,5 y 4 mM MgCl₂,
   nota: Para limitar la pérdida de nucleosomas en la concentración final baja, las diluciones deben realizarse de una en una, inmediatamente antes de la deposición en la mica APS.
4. Deposite 5-10 μL de la muestra de nucleosoma diluida en el centro de la pieza de APS-mica y déjela incubar durante dos minutos. Enjuague suavemente la muestra con 2-3 mL de dd H₂O para eliminar todos los componentes del tampón. Después de usar cada ~0.5 mL de dd H₂O, agite suavemente la mica para eliminar el exceso de agua de enjuague.
   nota: Se recomienda una jeringa desechable para este paso de enjuague.
5. Seque la muestra depositada bajo un ligero flujo de gas argón limpio.
   nota: La muestra ya está lista para ser fotografiada o puede almacenarse en un armario de vacío o en un desecador lleno de argón. Las muestras preparadas y almacenadas como se describe han sido fotografiadas un año después de la preparación sin pérdida de calidad. El protocolo se puede pausar aquí.

>3. Imágenes AFM estáticas de nucleosomas

1. Monte una punta AFM en el soporte de la punta. Utilice una punta que tenga una constante de resorte de ~40 N/m y una frecuencia de resonancia entre 300 y 340 kHz (consulte la Tabla de materiales para los voladizos utilizados aquí).
2. Monte la muestra preparada en la sección 3 en la platina AFM teniendo cuidado de no entrar en contacto con la superficie de la muestra.
3. Coloque el láser sobre el voladizo hasta que la suma esté en el máximo y ajuste los valores de deflexión vertical y lateral a casi cero.
4. Ajuste la sonda AFM para encontrar su frecuencia de resonancia y ajuste la amplitud de la unidad y establezca el tamaño de la imagen en 100 x 100 nm. Haga clic en el botón Activar para comenzar el acercamiento.
5. Una vez aproximado, optimice gradualmente el punto de ajuste de amplitud hasta que se vea claramente la superficie de la muestra. Aumente el tamaño de escaneo a 1 x 1 μm y la resolución a 512 x 512 píxeles. Haga clic en el botón de captura seguido del botón de activación para comenzar la adquisición de la imagen.
   nota: Las imágenes de la Figura 2 muestran el fondo suave que se puede esperar al obtener imágenes de estas muestras.

Resultados

Figura 1: Esquema del proceso para preparar mica funcionalizada APS para la obtención de imágenes AFM de nucleosomas. (A) un trozo de mica de ~0,1 mm de grosor tiene ambos lados recién escindidos. (B) La pieza de mica cortada se coloca rápidamente en diagonal en una cubeta que contiene la solución de APS y se prepara para incubar durante 30 min. (C) Después del paso de funcionalización de APS, la pieza de mica APS s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CENP-A/H4)2, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina del Norte	16-0010	Número de catálogo para 50 ug
H2A/H2B, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina del Norte	15-0311	Número de catálogo para 50 ug
Octámero H3, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina del Norte	16-0001	Número de catálogo para 50 ug
Kit de dispositivo de diálisis Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 ml	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	Número de catálogo para 10 dispositivos
cloruro de sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Número de catálogo de 500 mg
Filtros centrífugos Amicon Ultra-0,5 mL	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Número de catálogo para 8 dispositivos
Hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Número de catálogo para 25 mL
Tricina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Número de catálogo para 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Número de catálogo para 1 kg
Persulfato de amonio (AmmPS)	Bio-Rad, Hércules, CA	1610700	Número de catálogo para 10 g
Solución de acrilamida/Bis al 30%, 37,5:1	Bio-Rad, Hércules, CA	1610158	Número de catálogo para 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hércules, CA	1610800	Número de catálogo para 5 mL
4x Tampón de muestra de proteína Laemmli para SDS-PAGE	Bio-Rad, Hércules, CA	1610747	Número de catálogo para 10 mL
2-YO	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Número de catálogo para 10 mL
ageRuler Escalera de proteínas preteñida	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	Número de catálogo para 500 uL
Tinte de Coomassie Bio-Seguro™	Bio-Rad, Hércules, CA	1610786	Número de catálogo para 1 L
Toallitas no tejidas para salas limpias: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Carolina del Norte	TX604
Bloque de moscovita Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grado-1
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Número de catálogo para 25 g
Cinta adhesiva	Scotch-3M, San Pablo, MN
Sonda TESPA-V2 afm (para imágenes estáticas)	Sondas Bruker AFM, Camarillo, CA
Filtro Millex-GP, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Número de catálogo para 10 dispositivos
Sonda BL-AC10DS-A2 AFM (para HS-AFM)	Olimpo, Japón
Microscopio de fuerza atómica multimodo	Bruker-Nano/Veeco, Santa Bárbara, CA