Microscopía de fuerza atómica time-lapse de alta velocidad para capturar la dinámica de los nucleosomas

Resumen

Fuente: Stumme-Diers, M. P., et al., Sondeo de la estructura y dinámica de los nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica.J. Vis. Exp.(2019)

En este video, demostramos técnicas de imagen de microscopía de fuerza atómica de lapso de tiempo de alta velocidad, AFM, para estudiar la dinámica de los complejos de nucleosomas. A medida que la punta de AFM escanea la superficie del nucleosoma, detecta alteraciones en la altura del nucleosoma y registra el desenvolvimiento del ADN a lo largo del tiempo.

Protocolo

1. Conjunto de dilución continua de mononucleosomas

1. Genere y purifique un sustrato de ADN de aproximadamente 400 pb que contenga una secuencia de posicionamiento de nucleosoma Widom 601 descentrada.
   nota: Para limitar la formación no deseada de dinucleosomas, cada "brazo" que flanquea la secuencia de posicionamiento no debe exceder ~150 pb.
   1. Utilice el plásmido pGEM3Z-601 junto con los cebadores diseñados y amplifique el ADN del sustrato mediante PCR. Para el sustrato de 423 pb con longitudes de brazo de 122 y 154 pb utilizado aquí, utilice imprimadores delanteros (5'-CAGTGAATTAATACGACTC-3') e inversos (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3').
   2. Añada los tubos que contienen la mezcla de reacción a un termociclador precalentado a 95 °C. Ejecute el siguiente programa durante 33 ciclos después de una desnaturalización inicial durante 5 min a 95 °C: 30 s de desnaturalización a 95 °C, 30 s de recocido a 49 °C y 35 s de extensión a 72 °C. Ajuste una extensión final a 72 °C durante 10 min después de los 33 ciclos.
   3. Purifique el ADN de la mezcla de PCR utilizando un kit de purificación de PCR disponible en el mercado. Al eluir el ADN de la columna de limpieza de PCR, utilice 10 mM de tampón Tris (pH 7,5) en lugar del tampón de elución proporcionado por el kit.
      nota: Tenga especial cuidado de no transferir tampones entre los pasos de purificación. Un eluyente contaminado puede causar problemas posteriores al medir la concentración de ADN y/o puede alterar la concentración de sal inicial de la mezcla de ensamblaje de nucleosomas.
2. Determine la concentración de ADN midiendo la absorbancia del ADN purificado a 260 nm.
   1. Recoja un blanco en el espectrofotómetro UV VIS utilizando solo el tampón de elución Tris pH 7.5 de 10 mM. Recoger una medición del ADN purificado.
3. Una vez determinada la concentración, se introducen 25 pmol en un tubo de microfuga de 0,6 mL y se coloca en una centrífuga al vacío hasta que la solución sea apenas visible; esto suele ser de 30 min a 1 h.
   nota: El sustrato de ADN ya está listo para el ensamblaje de nucleosomas. De lo contrario, el protocolo puede detenerse aquí y el ADN almacenarse a -20 °C hasta su uso.
4. Coloque el tubo de microfuga que contiene el ADN de 25 pmol en el hielo y agregue los componentes del ensamblaje de nucleosomas en la Tabla 1, en el orden indicado. Cuando se hayan agregado todos los componentes, retire la mezcla del hielo e incube a temperatura ambiente (RT) durante 30 min.
   nota: Es fundamental que se tenga en cuenta el contenido de sal del tampón de histonas madre a la hora de calcular el NaCl necesario para alcanzar la concentración final de 2 M.
5. Ensamble los nucleosomas reduciendo la concentración de sal de 2 M de la mezcla a 200 mM utilizando una dilución de tasa continua.
   1. Llene una jeringa con 100 μL de tampón de dilución que contenga 10 mM de Tris pH 7,5 y colóquela en una bomba de jeringa.
   2. Dirija la aguja de la jeringa a través de un orificio preperforado en la tapa del tubo de microfuga, asegurándose de que se haga contacto con la mezcla de ensamblaje (Figura 1).
   3. Haga funcionar la bomba de jeringa a una velocidad de 0,75 μL/min durante 120 min.
      nota: La solución resultante de 100 μL contiene 250 nM de nucleosomas y 200 mM de NaCl.
   4. Transfiera la mezcla a un botón de diálisis MWCO de 10 K y dialice contra 200 mL de un tampón bajo en sal preenfriado (4 °C) que contenga 10 mM de Tris pH 7,5, 0,25 mM de EDTA y 2,5 mM de NaCl, durante 1 hora a 4 °C.
6. Para evaluar el contenido de histonas del ensamblaje de nucleosomas, prepare un gel SDS-PAGE discontinuo con un 15% de separación y un 6% de apilamiento como se describió anteriormente.
   1. Aliquot 10 - 20 μL del stock de nucleosomas a un tubo de microfuga y agregue 4x Laemmli Sample Buffer a una concentración de trabajo de 1 - 2x.
   2. Como control, repita esta preparación en un tubo de microfuga separado para 1 - 2 μg del stock de histonas. Calentar las muestras a 95 °C durante ~ 5 min.
   3. Cargue las muestras en carriles adyacentes entre sí en el gel. Agregue un búfer de muestra a los carriles no utilizados para promover una migración de banda uniforme.
   4. Pasa el gel a 65 V hasta que el frente del tinte se mueva a través del gel de apilamiento. Cuando se alcance el gel separador, auméntelo a 150 V y deje correr hasta que el frente del tinte haya migrado completamente fuera del gel.
   5. Desmonte la unidad de electroforesis y transfiera suavemente el gel a un recipiente de tinción lleno de dd H₂O. Deje reposar el gel durante 5 minutos con una agitación suave. Repita este proceso dos veces más con dd H₂O fresco usado cada vez.
      nota: El tinte de Coomassie utilizado en este protocolo no requiere los pasos de fijación típicos necesarios para los tintes de Coomassie (consulte la Tabla de materiales). Si se está utilizando otra preparación de Coomassie, ajuste los pasos de fijación según sea necesario.
   6. Retira el agua del enjuague final y agrega la mancha suficiente para cubrir el gel. Deje reposar el gel con una agitación suave durante al menos 1 h.
      nota: Para la agitación, el recipiente de tinción se puede colocar en cualquier aparato que promueva el movimiento de la mancha sobre el gel y, al mismo tiempo, mantenga el gel cubierto de líquido.
   7. Retire la mancha del recipiente y enjuague el gel con dd H₂O. Reemplace el dd H₂O y remoje el gel durante 30 min con una agitación suave. (El gel debe tener el aspecto que se muestra en la Figura 2, con una clara separación de las bandas de histonas).
7. Almacene los nucleosomas a 4 °C hasta su uso.
   nota: Cuando se almacenan en estas condiciones, los nucleosomas permanecen estables durante varios meses. El protocolo se puede pausar aquí.

>2. Imágenes AFM de lapso de tiempo de alta velocidad de la dinámica de nucleosomas

NOTA: El siguiente protocolo se proporciona para el instrumento HS-AFM desarrollado por el grupo Ando (Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón).

1. Prepare APS-mica para la obtención de imágenes líquidas.
   1. Fije la varilla de vidrio a la platina del escáner AFM con el pegamento del escáner de varilla de vidrio (consulte la Tabla de materiales). Déjalo secar durante un mínimo de 10 minutos.
   2. Haga trozos circulares de mica de ~0,1 mm de grosor con un diámetro de 1,5 mm perforándolos con una hoja de mica más grande. Utilice el pegamento para varillas de mica-vidrio HS-AFM (consulte la Tabla de materiales) para unir esta pieza de mica a la varilla de vidrio en el HS-AFM y séquela, sin tocarla, durante un mínimo de 10 minutos. Corte las capas con una cinta sensible a la presión hasta que se vea una capa bien cortada en la cinta.
   3. Diluir 1 μL de 50 mM de caldo de APS en 99 μL de dd H₂O para hacer una solución de 500 μM de APS. Deposite 2,5 μL de esta solución sobre la superficie de mica recién cortada y deje funcionalizar durante 30 min.
      nota: Para evitar el secado de la superficie durante la funcionalización, la tapa de un tubo de centrífuga cónico de 50 ml puede colocarse con un trozo de papel de filtro húmedo y colocarse sobre el escáner. La culata APS se diluye 3 veces menos para la adquisición de imágenes líquidas que para la obtención de imágenes estáticas para controlar la dinámica a una velocidad que se puede observar con AFM.
   4. Enjuague la mica con 20 μL de dd H₂O aplicando varios enjuagues de ~ 3 μL. Retire el agua por completo después de cada enjuague colocando una toallita no tejida en el borde de la mica. Después del enjuague final, coloque ~ 3 μL de dd H₂O en la superficie y déjelo reposar durante un mínimo de 5 minutos para eliminar cualquier APS no unido específicamente.
2. Coloque la sonda en el soporte HS-AFM y coloque el soporte en la platina AFM con la punta hacia arriba. Enjuague el soporte con ~ 100 μL de dd H₂O, seguido de dos enjuagues de ~ 100 μL de tampón de imágenes de nucleosomas filtrados de 0,22 μm que contiene 10 mM HEPES pH 7,5 y 4 mM MgCl₂.
3. Una vez realizados los enjuagues, llene la cámara con ~100 μL de tampón de imagen de nucleosomas, sumergiendo la punta. Ajuste la posición del voladizo hasta que sea golpeado por el láser. Enjuague la mica APS con 20 μL de tampón de imágenes de nucleosoma filtrado, usando ~ 4 μL por enjuague.
4. Diluya 1 μL del material de ensamblaje de nucleosomas en 250 μL de tampón de imagen de nucleosoma filtrado para obtener una concentración final de nucleosoma de 1 nM. Deposite 2,5 μL de esta dilución en la superficie y déjela reposar durante 2 min. Enjuague la superficie con ~ 4 μL de tampón de imagen de nucleosomas dos veces. Después del enjuague final, deje la superficie cubierta con el tampón de imagen.
   nota: Si la superficie no se enjuaga después de depositar la muestra de nucleosoma, la superficie se abarrotará rápidamente.
5. Coloque el escáner y la muestra en la parte superior del soporte de la punta de modo que la muestra quede boca abajo. Para comenzar la aproximación, utilice la función de aproximación automática con una amplitud de punto de ajuste, A_s cercana a la amplitud de oscilación libre A₀.
   nota: Idealmente, A_s = 0.95 A₀, sin embargo, operar al 82% de A₀ funcionará igual de bien si se tiene cuidado.
6. Ajuste el punto de ajuste hasta que la superficie esté bien rastreada.
   nota: Para minimizar la transferencia de energía desde la punta del AFM a la muestra de nucleosoma, la amplitud del voladizo debe mantenerse pequeña, con amplitudes tan bajas como 1 nm óptimas.
7. Establezca el área de la imagen entre 150 x 150 nm y 200 x 200 nm con una velocidad de adquisición de datos de ~300 ms por fotograma de imagen.
   nota: Este tamaño de imagen suele ser suficiente para capturar la dinámica de varios nucleosomas simultáneamente. Una superficie menos poblada puede requerir cambios en estos parámetros. La velocidad de fotogramas sugerida es suficiente para capturar la dinámica de los nucleosomas, como el bucle, el deslizamiento y el desenvolvimiento, entre otros (consulte la sección Resultados representativos a continuación).

Tabla 1: Reactivos necesarios para el ensamblaje continuo de nucleosomas en gradiente salino. Cada uno de los componentes enumerados se añade al tubo de microfuga que contiene el ADN purificado. Esto debe hacerse en el orden en que se enumeran los reactivos en la tabla, con el agua y el NaCl agregados primero, seguidos del dímero H2A/H2B y el tetrámero de histonas agregado al final. Si se van a utilizar octámeros de histonas preplegados, añádalos en la misma proporción que para el tetrámero anterior. * Tome nota del contenido de NaCl en cada una de las existencias de histonas y ajuste el NaCl de 5M para agregar en consecuencia, el [NaCl] final debe ser igual a 2M. (Ver Tabla de Materiales).

Resultados

Figura 1: Esquema de la bomba de jeringa utilizada para el ensamblaje de nucleosomas a microescala.La mezcla de montaje está colocada para estar en contacto con el extremo de la aguja de la jeringa. A medida que la bomba de jeringa suministra el tampón de dilución a la mezcla de ensamblaje, la concentración de NaCl disminuye, lo que promueve el ensamblaje de nucleosomas. Esta figura es una adaptación de Stumme-Diers et al.<...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plásmido pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
Imprimaciones de PCR	IDT, Coralville, IA	Pedido personalizado	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
Polimerasa DreamTaq	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Número de catálogo para 200 unidades
Kit de purificación PCR	Qiagen, Hilden, Alemania	28104	Número de catálogo para 50 unidades
Base Tris	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Número de catálogo para 250 g
EDTA	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Número de catálogo para 500 g
(CENP-A/H4)2, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina del Norte	16-0010	Número de catálogo para 50 ug
H2A/H2B, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina del Norte	15-0311	Número de catálogo para 50 ug
Octámero H3, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina del Norte	16-0001	Número de catálogo para 50 ug
Kit de dispositivo de diálisis Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 ml	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	Número de catálogo para 10 dispositivos
cloruro de sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Número de catálogo de 500 mg
Filtros centrífugos Amicon Ultra-0,5 mL	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Número de catálogo para 8 dispositivos
Hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Número de catálogo para 25 mL
Tricina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Número de catálogo para 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Número de catálogo para 1 kg
Persulfato de amonio (AmmPS)	Bio-Rad, Hércules, CA	1610700	Número de catálogo para 10 g
Solución de acrilamida/Bis al 30%, 37,5:1	Bio-Rad, Hércules, CA	1610158	Número de catálogo para 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hércules, CA	1610800	Número de catálogo para 5 mL
4x Tampón de muestra de proteína Laemmli para SDS-PAGE	Bio-Rad, Hércules, CA	1610747	Número de catálogo para 10 mL
2-YO	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Número de catálogo para 10 mL
PageRuler Escalera de Proteínas Preteñidas	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	Número de catálogo para 500 uL
Tinte de Coomassie Bio-Seguro™	Bio-Rad, Hércules, CA	1610786	Número de catálogo para 1 L
Toallitas no tejidas para salas limpias: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Carolina del Norte	TX604
Bloque de moscovita Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grado-1
Aminopropil silatrano (APS)	Sintetizado como se describe en 22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Número de catálogo para 25 g
Cinta adhesiva	Scotch-3M, San Pablo, MN
Pegamento industrial Krazy Aron Alpha	Toagosei América, West Jefferson, OH	AA480	Número de catálogo para tubo de 2 g
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	Número de catálogo para 100 g
Filtro Millex-GP, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Número de catálogo para 10 dispositivos
Sonda BL-AC10DS-A2 AFM (para HS-AFM)	Olimpo, Japón
Compuesto FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japón
Compuesto FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japón
Microscopía de fuerza atómica time-lapse de alta velocidad	Toshio Ando, Instituto de Ciencias de la Nano-Vida, Universidad de Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japón