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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las pautas institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local
1. Fijación primaria, postfijación, incrustación, seccionamiento y contraste
- Preparar 1,6 mL de solución fijadora primaria (2,5% de glutaraldehído en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,3)) en un tubo de microcentrifugación de 2 mL. Almacenarlo a 5 °C durante un máximo de 14 días.
- De la biopsia muscular o del músculo completo, aísle una muestra pequeña, que tenga un diámetro máximo de 1 mm en cualquier dirección y que sea un poco más larga en la dirección de la fibra longitudinal que en la sección transversal (con fines de orientación).
- Coloque la muestra en el tubo que contiene la solución de fijación primaria fría. Guárdelo a 5 °C durante 24 h.
- Lave la muestra cuatro veces (15 min entre cada lavado) en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,3). Con ayuda de pipetas de transferencia, retire el tampón usado del tubo dejando la muestra intacta y, a continuación, añada el tampón fresco.
nota: Después del lavado final, la muestra puede almacenarse en el tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M a 5 °C durante varios meses. El protocolo se puede pausar aquí.
- Postfijo con tetróxido de osmio al 1% (OsO4) y ferrocianuro de potasio al 1,5% (K4Fe(CN)6) en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,3) durante 120 min a 4 °C.
nota: El uso de ferrocianuro de potasio al 1,5% (K4Fe(CN)6) es esencial para un contraste óptimo de partículas de glucógeno.
- Enjuague dos veces en agua bidestilada a temperatura ambiente (RT).
- Deshidratar sumergiéndolo en una serie graduada de alcohol (etanol) a RT utilizando las siguientes concentraciones: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) y 100% (10 min).
nota: En cada paso, la muestra se sumerge en etanol, que posteriormente se elimina solo parcialmente para evitar que se seque la muestra. Finalmente, se desecha el etanol sobrante.
- Infiltrar con mezclas graduadas de óxido de propileno y resina epósdica en RT utilizando las siguientes relaciones de volumen (óxido de propileno/resina epossídica): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (durante la noche). Al día siguiente, incrustar las muestras en resina epossídica 100% fresca en moldes y polimerizar a 60 °C durante 48 h.
- Corte secciones ultrafinas (60-70 nm) de fibras orientadas longitudinalmente y recójalas en rejillas de cobre de un solo orificio de la siguiente manera.
- Monte el bloque de una muestra en el soporte del ultramicrótomo.
- Recorte el bloque en la superficie con una cuchilla de afeitar para alcanzar el nivel del tejido.
- Monte un cuchillo de diamante (ultra cut 45) delante de la muestra y alinee la superficie de la muestra paralela al cuchillo.
- Producir una sección semifina (1 μm) con el cuchillo de diamante para comprobar la orientación de la muestra. Teñir la sección semifina con azul de toluidina para la observación con microscopía óptica.
- Recorte aún más el bloque para reducir el área de interés con el fin de obtener secciones ultrafinas adecuadas.
- Corte secciones ultrafinas (60-70 nm) con un segundo cuchillo de diamante (ultra cut 45).
- Recoja 1-2 secciones en rejillas de cobre de un solo orificio usando un Perfect Loop.
nota: La rejilla de cobre de un solo orificio tiene un solo orificio en el medio con membrana de soporte Formvar.
- Contraste las secciones con acetato de uranilo y citrato de plomo sumergiendo las rejillas anteriores en una solución de acetato de uranilo (0,5% en agua bidestilada) durante 20 min, y luego en una solución de citrato de plomo (1% en agua bidestilada) durante 15 min. Lave las rejillas en agua bidestilada entre y después de las dos manchas.
nota: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Imágenes
- Encienda el microscopio electrónico de transmisión (operado a un voltaje de aceleración de 80 kV), la computadora y el software de grabación de imágenes. Grabe imágenes digitales con una cámara CCD digital de escaneo lento de 2 k x 2 k y el software de imagen asociado.
- Inserte la rejilla con varias secciones en la platina del microscopio.
- Criba la rejilla inicialmente con un aumento bajo (por ejemplo, x100) para determinar la calidad de las secciones (es decir, agujeros en la membrana de soporte, escombros, etc.) y elija las secciones de mejor calidad. A bajo aumento, determine la dirección de las fibras musculares.
- A continuación, aumente el aumento con el haz centrado en una fibra periférica de la sección. Enfoque la imagen con un aumento superior a 30 k para garantizar suficientes detalles finos en la imagen, guiado por una transformación rápida de Fourier en tiempo real, si está disponible. Por último, grabe imágenes con un tiempo de exposición de 1 s con el aumento deseado.
- Adquirir un total de 24 imágenes de una fibra seleccionada al azar, es decir, 12 imágenes del espacio miofibrilar y 12 imágenes del espacio subsarcolema, con un aumento entre 10 k y 40 k. Asegúrese de que las imágenes se distribuyan a lo largo y ancho de la fibra en un orden aleatorio pero sistemático para obtener resultados imparciales (Figura 1A)
nota: El aumento óptimo depende de la resolución de la cámara disponible y del tamaño de las micrografías. El objetivo es lograr una resolución final, en la que los diámetros de las partículas de glucógeno puedan medirse en pasos de 1 nm, e incluir un área total de la región miofibrilar de al menos 70 μm2 y una longitud total de la fibra de al menos 25 μm distribuida en 12 imágenes del espacio miofibrilar y 12 imágenes del espacio subsarcolema por fibra. respectivamente. Lo más probable es que las 24 imágenes por fibra den una precisión (coeficiente de error) del contenido volumétrico de las diferentes reservas de glucógeno entre 0,1 y 0,2 en fibras individuales de músculos esqueléticos humanos, de ratas y ratones (Figura 2E).
- Repita los pasos 2.4 y 2.5 hasta obtener un total de 6-10 fibras. Si es necesario, corte secciones adicionales (separadas por al menos 150 μm para evitar la superposición de fibras ya fotografiadas) y repita los pasos 1.9-2.5.
3. Análisis de imágenes
- Importe imágenes a ImageJ haciendo clic en Archivo > Abrir.
- Establezca la escala global para que coincida con el tamaño original de la imagen haciendo clic en Analizar > Establecer escala.
- Acérquese al 100% haciendo clic en Imagen > Acercar >.
- Mida el grosor de un disco Z por imagen del espacio miofibrilar (12 por fibra) utilizando la herramienta Línea recta del menú Herramientas (Figura 1D). Calcule el grosor promedio del disco Z de cada una de las 6-10 fibras.
- Defina 2-3 fibras con el disco Z promedio más grueso como fibras de tipo 1 y 2-3 fibras con el disco Z promedio más delgado como fibras de tipo 2. Descarte las 2-4 fibras intermedias para análisis posteriores (Figura 1E).
NOTA: Los siguientes pasos se repiten para cada una de las 4-6 fibras de la muestra. Las fracciones de volumen de glucógeno se estiman mediante conteo de puntos. El tamaño de las cuadrículas se elige para obtener una alta precisión satisfactoria de las estimaciones. Esto a menudo se obtiene logrando 250 golpes, lo que luego dicta el número total de puntos necesarios y, a su vez, el área por punto.
- Utilice la herramienta Línea segmentada para medir la longitud de la miofibrilla más externa visible justo debajo de la región subsarcolemal (Figura 2A).
nota: Esta longitud se utiliza para expresar el glucógeno subsarcolemático por área superficial (es decir, la longitud de la miofibrilla más externa multiplicada por el grosor de la sección (60 nm); ver paso 4.5). Por lo tanto, solo se incluye en el análisis la región subsarcolema, que está representada por esta longitud.
- Inserte una cuadrícula haciendo clic en Analizar > Herramientas > Cuadrícula y establezca el Área por punto en 32,400 nm2. Cuente el número de impactos dentro de la longitud disponible en las 12 imágenes subsarcolemales, donde una cruz golpea el glucógeno subsarcolemático (Figura 2A). Un golpe se define como una partícula de glucógeno que está presente en la esquina superior derecha de una cruz.
- Inserte una cuadrícula haciendo clic en Analizar > Herramientas > Cuadrícula y establezca el área por punto en 160,000 nm2. Cuente el número de impactos en las 12 imágenes miofibrilares, donde una cruz golpea el espacio intramiofibrilar (Figura 2B).
- Inserte una cuadrícula haciendo clic en Analizar > Herramientas > Cuadrícula y establezca el Área por punto en 3.600 nm2. Cuente el número de impactos en las 12 imágenes miofibrilares, donde una cruz golpea el glucógeno intramiofibrilar (Figura 2C).
- Inserte una cuadrícula haciendo clic en Analizar > Herramientas > Cuadrícula y establezca el Área por punto en 32,400 nm2. Cuente el número de impactos en las 12 imágenes miofibrilares, donde una cruz golpea el glucógeno intermiofibrilar (Figura 2D).
- Con la herramienta Línea recta, mida el diámetro de cinco partículas de glucógeno elegidas al azar de cada piscina para cada una de las 12 imágenes para obtener un promedio de 60 partículas por piscina por fibra.
NOTA: El promedio de 60 partículas cubre en gran medida la variación dentro de la fibra (Figura 2F).
