1. Línea celular y cultivo celular
- Cultive macrófagos RAW 264.7 en el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 10% (vol/vol) de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, 100 UI/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2. Reemplace los medios de crecimiento cada dos días.
- Cuando las células confluyan en un 80%, lave la placa dos veces con PBS estéril.
- Separe las células añadiendo 1.000 μL de tripsina-EDTA al 0,5% e incube la placa de cultivo celular durante 3-5 min en una incubadora humidificada a 37 °C.
- Examine la placa bajo un microscopio óptico para confirmar la disociación celular. Agregue 10 mL de medio de crecimiento que contenga 10% de FBS para inactivar la tripsina.
- Recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 50 mL y centrifugue a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Reimplante suavemente las células en el medio de cultivo celular completo y determine el recuento de células y la viabilidad mediante la tinción con azul de tripano (0,4 %).
nota: La viabilidad celular mínima recomendada para este experimento es del >90%.
- Coloque cubreobjetos de vidrio estériles en los pocillos de una placa de 24 pocillos con pinzas esterilizadas en autoclave. Siembre las células en cubreobjetos a una densidad de 1 x 106 células/mL e incube la placa durante la noche en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
- Cambie el medio de cada pocillo con un medio completo fresco de 500 μL antes del tratamiento. Trate previamente los macrófagos con vehículo (DMSO u otros solventes utilizados para disolver EIPA) o el inhibidor de la macropinocitosis 5-(N-etil-N-isopropil)-amilorida (EIPA, 25 μM) durante 30 min.
- Tratar las células con vehículos y estimuladores de la macropinocitosis para promover el altercado de la membrana: forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, 1 μM, 30 min) y factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min).
nota: También se pueden utilizar inhibidores alternativos [p. ej., latrunculina A (1 μM, 30 min) o citocalasina D (1 μM, 30 min)] y estimuladores [p. ej., factor de crecimiento epidérmico (EGF, 100 ng/mL, 10 min) o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] de la macropinocitosis para caracterizar la macropinocitosis en macrófagos y otros tipos de células. Las células pueden requerir inanición de suero durante la noche antes del tratamiento con estimuladores fisiológicos de la macropinocitosis. Es importante tener en cuenta que habrá que determinar las concentraciones y los tiempos de incubación más efectivos para estimular la macropinocitosis en otros tipos de células.
>2. Fijación SEM
- Después del tratamiento, aspire los medios de los pocillos y lave los cubreobjetos con PBS helado dos veces.
- Fije las células (4% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído en cacodilato de sodio 0,1 M) durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de incubación nocturna en el fijador a 4 °C.
- Lave e incube suavemente los cubreobjetos con 500 μL de los siguientes reactivos sin alterar la monocapa celular.
- Lavar una vez en cacodilato de sodio 0,1 M e incubar durante 15 min.
- Lavar dos veces con dH2O con 10 min de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 25% con 10 minutos de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 50% con 10 min de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 75% con 10 min de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 80% con 10 minutos de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 95% con 10 minutos de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol 100%. Realizar 10 min de incubación en cada lavado.
nota: El cambio/reemplazo de los reactivos debe realizarse rápidamente para evitar el secado al aire de las células. Los cubreobjetos pueden dejarse en etanol al 100% durante varios días a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, agregue etanol 100% adicional y cubra los pocillos con parafilm para evitar el secado al aire de la muestra.
>3. Secado de puntos críticos
- Coloque los cubreobjetos en un secador de punto crítico y cúbralos con etanol al 100%. Presione el botón de encendido y abra el tanque de CO2.
- Presione el botón Cool durante aproximadamente 30 s hasta que la temperatura disminuya a 0 °C. Presione el botón Fill hasta que aparezca una burbuja en la ventana de la cámara.
- Presione el botón de purga hasta que desaparezca el olor a etanol del escape de purga. Presione el botón Cool nuevamente hasta que la temperatura disminuya a 0 °C.
- Vuelva a presionar los botones Llenar y Purgar para apagarlos y cerrar el tanque de CO2. Vuelva a presionar el botón Cool para apagarlo y presione el botón Heat.
- Ajuste la temperatura a 42 °C y la presión a 1.200 psi. Una vez que la presión y la temperatura se estabilicen, presione el botón Bleed para permitir que la presión disminuya lentamente.
- Una vez que la presión de la cámara alcance los 150 psi, presione el botón de ventilación y espere hasta que la presión disminuya a 0 psi. Apague la secadora de puntos críticos y retire los cubreobjetos.
- Monte cubreobjetos en soportes de muestras de aluminio SEM con lengüetas adhesivas de carbono y esté sujeto a un recubrimiento de pulverización catódica con oro/paladio en un recubridor de pulverización catódica.
- Encienda el botón de encendido y espere hasta que la aspiradora alcance los 30 mTorr. Enjuague la cámara para eliminar la humedad y el aire apagando el interruptor de gas y girando la válvula de gas fino en sentido contrario a las agujas del reloj.
- Una vez que el vacío aumente a 200 mTorr, apague el interruptor de gas y espere hasta que el vacío alcance los 30 mTorr. Repita este paso 3 veces.
- Presione el botón del temporizador y ajuste la perilla de voltaje hasta que el medidor marque 10 mA. Retire los cubreobjetos recubiertos de la cámara.
nota: Siga las instrucciones del fabricante para realizar el secado de puntos críticos y el recubrimiento por pulverización catódica de la muestra.
>4. Imagen y cuantificación
- Inserte cubremuestras en la cámara de un microscopio electrónico de barrido. Cierre la puerta y presione el botón Evac.
- Abra el software de operación SEM. Ajuste la tensión de aceleración a 15 kv y la distancia de trabajo a 10 mm.
- Presione el botón Coordenadas y muévase por el controlador hasta que aparezcan las celdas en el centro de la pantalla de observación. Establezca el aumento en 3.500x e imagine la muestra haciendo clic en el botón Foto.
nota: Utilice un nivel de aumento más alto (de 8.500x a 16.000x) para mostrar la membrana plasmática con mayor detalle.
