Microscopía de fluorescencia intravital para estudiar la formación de trombos microvasculares

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Predisposición de los animales

1. Pesar un ratón y cargar el fármaco correspondiente (por ejemplo, el cannabinoide, 5 mg/kg de peso corporal (pc)) en una jeringa de insulina. Administrar el fármaco 30 minutos antes de la inducción del trombo.
2. Sujetando el cuello del ratón entre el pulgar y el índice y la cola del ratón con el dedo meñique, estire al animal e inyecte el fármaco por vía intraperitoneal (ip) en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen. Vuelve a meter al animal en la jaula durante 15 min.
3. Preparar la anestesia con ketamina (90 mg/kg de peso corporal) y xilacina (25 mg/kg de peso corporal) 15 minutos antes de la inducción del trombo, anestesiar al ratón. Coloque al ratón en la jaula, tire ligeramente de la cola e inyecte los anestésicos ip con una jeringa de insulina.
4. Vuelva a colocar al ratón en la jaula hasta el inicio de la anestesia. Para verificar que haya suficiente anestesia, pellizque la cola con fórceps.
5. Cargue 0,05 mL de dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína descongelado (FITC-dextrano; 5%, 150 kDa) en una jeringa de insulina. Mientras llena la jeringa, asegúrese de que no queden burbujas de aire, porque incluso las pequeñas burbujas de aire administradas por vía intravenosa (iv) pueden ser letales para el animal.
6. Coloque el ratón anestesiado sobre una placa calefactora en posición boca abajo. Ajuste la placa calefactora a 37 °C.
7. Ponga ungüento para los ojos en la córnea del ratón. Desinfectar la piel y utilizar instrumental estéril.
8. Coser dos suturas de polipropileno 7/0 en el borde craneal y caudal de la oreja derecha. Coloque los puntos lo más cerca posible del borde y lo más proximal posible a la base (Figura 1B).
9. Coloque el ratón en la posición dorsal. Fije todas las patas a la plataforma de vidrio acrílico con tiras adhesivas. Enganche una sutura debajo de los dientes frontales y coloque la cabeza en dorsiflexión pegando la sutura al vidrio acrílico con tiras adhesivas.
10. Translocar al animal en la plataforma bajo el estereomicroscopio de operación. Utilice un aumento de 16X.

>2. Preparación de la vena yugular izquierda e inyección de FITC-Dextran

>Nota: Para la microscopía del oído derecho, prepare la vena yugular izquierda.

1. Con un bisturí, haga una incisión de 5 mm en la piel del lado izquierdo del cuello en dirección craneocaudal. Diseccionar el tejido subcutáneo con micropinzas y microtijeras. Ya sea ligar los vasos cruzados con suturas de poliéster 8/0 o con electrocoagulación.
2. Libere la vena de su adventicia utilizando micro pinzas y microtijeras sin tocar el vaso.
3. Utilice la jeringa de insulina preparada para la inyección del tinte fluorescente. Agarre con cuidado la pared del vaso con las micropinzas, sin perforar la vena. Penetrar la pared del vaso distendido con la jeringa e inyectar FITC-dextrano iv.
4. Detenga el sangrado después de retirar la jeringa con hisopos de algodón. Evite la contaminación del oído con sangre y tintes.

>3. Posicionamiento del oído derecho para microscopía de fluorescencia intravital

1. Transfiera el animal en la placa calefactora a una construcción de vidrio acrílico con una ranura para la placa calefactora y un plano de 0,5 cm de altura para colocar la oreja.
2. Fije el animal boca abajo en la placa calefactora con tiras adhesivas. Coloque el cartílago relativamente fuerte y convexo en la base de la oreja, junto a los planos de 0,5 cm de altura de la oreja (Figura 1B), de modo que la parte apical de la oreja pueda colocarse plana en el plano.
3. Agregue una gota de NaCl al 0,9% a temperatura ambiente al plano del vidrio acrílico para posicionar la oreja. Colocar la oreja derecha, con las suturas predispuestas en su lado ventral cóncavo hacia abajo, sobre la gota de NaCl al 0,9%. Con hisopos de algodón, absorba la gota de NaCl y deje que las fuerzas capilares unan el plano de la oreja al vidrio acrílico.
4. Pega las suturas al vidrio acrílico para fijar la posición de la oreja.
5. Agregue una gota de NaCl a temperatura ambiente al 0,9% en el lado dorsal convexo de la oreja. Coloque con cuidado un cubreobjetos (0,5 cm de diámetro) en la oreja sin comprimir los vasos basales que entran en la oreja. Con hisopos de algodón, elimine la mayor cantidad posible de NaCl de debajo del cubreobjetos para minimizar la distancia entre el cubreobjetos y los vasos objetivo del oído.

>4. Microscopía de fluorescencia intravital e inducción de trombos en el oído derecho

1. Ajuste el microscopio de fluorescencia intravital para la visualización de FITC-dextrano (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Utilice una lámpara de mercurio variable de 100 W como fuente de luz. Conecte una cámara CCD en blanco y negro de alta resolución a una grabadora de DVD.
2. Transfiera el animal en el vidrio acrílico que contiene la placa calefactora con la oreja abducida fija al escritorio del microscopio de fluorescencia intravital.
3. Utilizando un aumento de 20X (apertura numérica de 20X/0,95) y una intensidad de luz del 20%, busque un vaso venoso de 50 a 60 μm de diámetro y con un flujo sanguíneo anterógrado de 400 a 600 μm/s.
4. Añada una gota de agua a temperatura ambiente al cubreobjetos para sumergir en agua el objetivo de aumento de 63x (apertura numérica de 63X/0,95). Utilice una jeringa con una cánula de 1 mm de diámetro y coloque la gota sobre el objetivo del microscopio. Agregue solo el agua suficiente para hacer contacto con el cubreobjetos y el objetivo con la gota de agua.
5. Inmediatamente después de la aplicación de la gota de agua, comience a registrar el recipiente durante 20 s con una intensidad de luz del 20% para la medición fuera de línea del diámetro y el flujo sanguíneo.
6. Iniciar la inducción del trombo 5 min después de la inyección de FITC-dextrano. Para ello, aumente la intensidad de la luz al 100%.
7. Durante la inducción del trombo, cierre la abertura del microscopio durante 2 segundos en un período de 30 segundos para verificar el flujo sanguíneo. En caso de que el flujo sanguíneo persista, vuelva a abrir la abertura. En caso de interrupción del flujo sanguíneo, observe el vaso durante 30 s.
   nota: El vaso se clasifica como ocluido si el flujo permanece inmóvil durante 30 s o más o si la sangre fluye retrógradamente. Si el flujo sanguíneo ortógrado comienza de nuevo, abra completamente la abertura y continúe la inducción del trombo hasta que ocurra la oclusión del vaso como se describió anteriormente. Durante la inducción temprana del trombo, asegúrese de que los momentos en que se cerró la abertura para verificar el flujo sanguíneo sean lo más cortos posible para mantener una epiiluminación casi continua. Más tarde, durante el crecimiento del trombo, el vaso se perfunde con un colorante menos fluorescente, por lo que se puede observar continuamente.
8. Seleccione y ocluya 5 vasos por oreja. Limite el tiempo de inducción del trombo bajo el microscopio a aproximadamente 1 h después de la inyección de FITC-dextrano.

Figura 1. Preparación de la vena yugular (A) y colocación de la oreja para microscopía intravital (B). (A) Usando la operación de estereomicroscopio, se prepara la vena yugular derecha. Las suturas para la colocación de la oreja izquierda se suturan antes de la inyección de FITC-dextrano. La herida de la disección previa de la vena yugular izquierda se cierra con suturas transcutáneas (B). La oreja izquierda se fija con suturas de polipropileno 7/0. Un cubreobjetos se coloca cuidadosamente sin comprimir los vasos basales de la oreja. Una placa calefactora mantiene la temperatura corporal del animal durante todo el experimento.