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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Preparación de los citospins
- Prepare dos citospins con células mononucleares de las muestras de pacientes (es decir, un cytospin para la tinción de inmunofluorescencia γH2AX y un cytospin para la tinción de inmunofluorescencia combinada γH2AX y 53BP1) por centrifugación (300 x g, 10 min) de 1,0 x 105 células para cada preparación (Figura 1 y 2).
2. Tinción de inmunofluorescencia γH2AX y 53BP1
- Fijación y permeabilización: Fijar las células con 200 μL de PFA al 4% durante 10 min. Después de la fijación, lave las células suavemente tres veces con 30 ml de PBS durante 5 minutos cada una en un agitador de laboratorio. A continuación, permeabilizar las células con 200 μL de Octoxinol 9 al 0,1% durante 10 min. Lave las células suavemente tres veces con 30 ml de solución bloqueadora al 5% durante 5 minutos cada una en un agitador de laboratorio. Bloquee las células en 30 mL de solución bloqueante fresca al 5% durante 1 h.
- Incubación con anticuerpos
- Incubar una preparación de las células con un anticuerpo monoclonal anti-γH2AX de ratón (1:500) y la otra preparación de las células con un anticuerpo monoclonal anti-γH2AX de ratón (1:500) y un anticuerpo policlonal anti-53BP1 de conejo (1:500) durante la noche a 4 °C.
- Después de la incubación, lavar las células suavemente 3 veces con 30 ml de solución bloqueadora al 2% por cada 5 minutos en un agitador de laboratorio.
- Retire la solución bloqueante e incube la primera preparación de las células con un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con Alexa488 (1:500) y la segunda preparación de las células con un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con Alexa488 (1:500) y un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa555 (1:500) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Medio de montaje: Coloque el portaobjetos con las células en un recipiente y lave las células suavemente tres veces con 30 ml de PBS por cada 5 minutos en un agitador de laboratorio. Retire el PBS y monte las celdas con un medio de montaje que contenga 4,6-diamidino-2-fenilindol. Coloque con cuidado un cubreobjetos en la parte superior del medio de montaje para que no queden burbujas de aire. Espere al menos 3 h para que el medio de montaje se endurezca antes de analizar las células mediante microscopía de fluorescencia.
3. Análisis de los focos γH2AX y 53BP1
- Microscopía de fluorescencia: Analice los focos γH2AX y 53BP1 en los núcleos celulares con un microscopio de fluorescencia equipado con filtros para DAPI, Alexa 488 y Cy3 durante la obtención de imágenes con un aumento objetivo de 100X. Grabe imágenes con una cámara y procese las imágenes con el software de imagen adecuado.
