Microscopía de inmunofluorescencia para el análisis de roturas de doble cadena de ADN

Resumen

Fuente: Popp, H. D., et al. Microscopía de inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN. J. Vis. Exp. (2017)

En este video, describimos la técnica de microscopía de inmunofluorescencia para detectar proteínas específicas de respuesta al daño del ADN localizadas en los sitios de roturas de doble cadena del ADN en células mononucleares humanas. Las proteínas son reconocidas por anticuerpos primarios específicos, que a su vez se unen a anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos que emiten fluorescencia durante la visualización microscópica, lo que permite la visualización de las proteínas como focos fluorescentes distintos dentro de los núcleos celulares.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Preparación de los citospins

1. Prepare dos citospins con células mononucleares de las muestras de pacientes (es decir, un cytospin para la tinción de inmunofluorescencia γH2AX y un cytospin para la tinción de inmunofluorescencia combinada γH2AX y 53BP1) por centrifugación (300 x g, 10 min) de 1,0 x 10⁵ células para cada preparación (

Resultados

Figura 1: Dispositivo para la preparación de los citospins.

Figura 2: Preparación de los citospins. Se preparan dos citoespines de cada muestra por centrifugación de 1,0 x 10⁵ células a 300 x g durante 10 min. Un citoespín se utiliza para la tinción de inmunofluorescencia γH2AX y otro citoespín se.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Portaobjetos de microscopio de diagnóstico	Termo Científico	ER-203B-CE24	Portaobjetos de microscopio
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	Centrífuga de sobremesa
Dispositivo Cytospin
tapa	Heraeus	76003422	Tapa para trabajar sin microtubos
Contenedor Cyto	Heraeus	75003416	Contenedor Cyto con 2 orificios cónicos
Portaclips	Heraeus	75003414	Soporte para sujetar un contenedor de citos y una corredera
Inserto de soporte	Heraeus	75003417	Inserto de soporte para sujetar un soporte de clip
Paraformaldehido	Sigma-Aldrich	P6148	Agente de fijación
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	D8537	Solución salina equilibrada
Bloqueador de productos químicos	Merck Millipore	Año 2170	Agente de bloqueo
Anticuerpo monoclonal anti-γH2AX de ratón (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Anticuerpo primario para la detección de γH2AX
Anticuerpo policlonal anti-53BP1 de conejo (NB100-304)	Novus Biológicos	NB100-304	Anticuerpo primario para la detección de 53BP1
Anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Anticuerpo secundario
Anticuerpo anti-conejo Alexa Fluor 555 conjugado contra el burro	Invitrogen	A-31572	Anticuerpo secundario
Medio de montaje Vectashield	Laboratorios de vectores	H-1200	Contiene DAPI para la tinción de ADN
Axio Scope.A1	Zeiss	490035	Microscopio de fluorescencia
Cámara CCD Cool Cube 1	Metasistemas	H-0310-010-MS	Sistema de cámara para grabación digital
Software de ISIS	Metasistemas	No aplicable	Software de microscopio