Detección de la unión de la vitronectina a las superficies bacterianas mediante citometría de flujo

Abstract

Fuente: Singh, B. et al., Ensayos para estudiar el papel de la vitronectina en la adhesión bacteriana y la resistencia sérica.J. Vis. Exp.(2018)

Este video muestra la detección de la interacción de la vitronectina con las proteínas de superficie bacterianas. El análisis de citometría de flujo mide la señal de fluorescencia de los anticuerpos marcados con fluorescencia unidos a la vitronectina, confirmando su presencia en la superficie bacteriana. Esta técnica proporciona información sobre las interacciones huésped-patógeno y las posibles terapias para infecciones bacterianas.

Protocol

1. Análisis de Vitronectina, Vn como ligando de proteínas de superficie bacteriana

1. Detección de la unión de Vn en la superficie bacteriana mediante citometría de flujo
   nota: En citometría de flujo, utilizamos dispersión lateral y dispersión directa para controlar los eventos positivos. Para examinar las interacciones con Vn, Haemophilus influenzae tipo f, se seleccionaron aislados clínicos de Hif (n=10) junto con E. coli BL21 (DE3) como control negativo (Figura 1A).
   1. Cultivo: Aislados clínicos de Hif en medio de infusión cerebro-corazón (BHI) suplementado con 10 μg/mL de nicotinamida, adenina dinucleótido (NAD) y hemina a 37 °C con agitación a 200 rpm. Utilice el medio Luria-Bertani para cultivar E. coli. Coseche Hif en la fase media del logaritmo (densidad óptica, OD₆₀₀ = 0,3) y vuelva a suspender las bacterias en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, que contenga 1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) (tampón de bloqueo; PBS-BSA). Ajuste la suspensión a 10⁹ unidades formadoras de colonias, UFC/mL.
   2. Transfiera las alícuotas que contienen 5 x 10⁶ UFC a tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 mL (12 x 75 mm²) y agregue 1 mL de tampón de bloqueo. Centrifugar la suspensión a 3.500 × g a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos para granular las bacterias, luego aspirar cuidadosamente para eliminar el sobrenadante sin alterar la pastilla.
   3. Vuelva a suspender los gránulos bacterianos con 50 μL de tampón de bloqueo que contenga 250 nM Vn e incube las muestras durante 1 h a RT sin agitar. Después de la incubación, granule las bacterias por centrifugación a 3.500 x g durante 5 minutos, luego lave los gránulos tres veces usando PBS y pasos de centrifugación similares.
   4. Al gránulo bacteriano, añadir 50 μL de anticuerpos policlonales primarios Vn (pAb) anti-Vn humano de oveja con una dilución de 1:100 en PBS-BSA. Incubar la suspensión durante 1 h en RT, luego lavar las bacterias tres veces con PBS para eliminar los anticuerpos no unidos (como se describe en el paso 1.1.3).
   5. A continuación, añadir 50 μL de PBS-BSA que contiene pAbs anti-ovejas conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) para burros (dilución 1:100) e incubar en RT durante 1 h en la oscuridad.
   6. Prepare un control en blanco incubando bacterias con tampón de bloqueo solo y pAbs sin Vn.
   7. Lavar las bacterias tres veces con 1 mL de tampón de bloqueo y pellet la suspensión por centrifugación, como se describe en la sección 1.1.2. Por último, resuspender el pellet bacteriano con 300 μL de PBS y analizarlo por citometría de flujo.

Results

Figura 1: El serotipo f de Haemophilus influenzae se une a Vn a través del pH expresado en la superficie.(A) Resultados de citometría de flujo que muestran la unión de Vn a células de aislados clínicos de Hif. Cada aislado clínico (5 x 10⁶ UFC) se incubó con 250 nM de Vn humano. El ligando unido se detectó utilizando pAbs anti-Vn de ovejas y antic...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml	Halcón BD	60819-138	Estilo de 12 × 75 mm
Albúminas séricas bovinas (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Apto para el cultivo celular
Citómetro de flujo	BD Biociencias	651154	Grado de análisis celular para aplicaciones de investigación
Vitronectina (Vn) a partir de plasma humano	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Grado de cultivo celular
Huésped de E. coli (E. Coli BL21)	Novagen	69450-3	Huésped de expresión de proteínas
Anticuerpos anti-ovejas de burro conjugados por FITC	AbD Serotec	STAR88F	Policlonal
Anticuerpos Vn antihumanos en ovejas	AbD Serotec	AHP396	Policlonal