La técnica de fotoconversión para explorar la dinámica de las células inflamatorias en pupas de insectos

Abstract

Fuente: Weavers, H. et al., Seguimiento in vivo a largo plazo de la dinámica celular inflamatoria dentro de las pupas de Drosophila.J. Vis. Exp. (2018)

El video demuestra el uso de la fotoconversión para estudiar la dinámica celular inflamatoria en pupas de Drosophila. Los hemocitos verdes son atraídos hacia el epitelio herido, seguido de una migración distante. La fotoconversión cambia ciertos hemocitos de verde a rojo, lo que facilita su seguimiento de movimiento.

Protocol

Este protocolo consta de cuatro pasos secuenciales principales: (1) Preparación de las existencias de Drosophila y estadificación de las pupas de Drosophila, (2) Disección y montaje de la pupa, (3) Herida de la pupa, (4) Imágenes confocales in vivo de lapso de tiempo.

>1. Preparación de cepas de Drosophila y puesta en escena de pupas

1. Obtener las existencias apropiadas de Drosophila (ver Introducción y Tabla de Materiales).
2. Recoja moscas adultas jóvenes y sanas del genotipo apropiado.
   1. Seleccione moscas adultas usando almohadillas de gas de dióxido de carbono para anestesiar brevemente a las moscas y un pincel fino para transferir moscas del genotipo o género apropiado a un frasco de recolección.
   2. Agregue 20 hembras vírgenes y 20 machos a cada vial que contenga medios estándar de alimento para moscas (una mezcla de harina de maíz-melaza-agar, ver Tabla de Materiales) suplementados con levadura.
3. Para una generación óptima de pupas, incline las moscas adultas cada día sobre alimento nuevo en viales frescos, manteniendo todos los viales a 25 °C.
   nota: Si se utiliza el sistema de secuencia de activación ascendente Gal4 (Gal4-UAS) para impulsar la expresión génica específica del linaje, todos los pasos deben realizarse a 25 °C o más, ya que el sistema Gal4-UAS es sensible a la temperatura.
4. 18 h antes de la sesión de imagen programada, seleccione al menos 10 pre-pupas blancas recién formadas (Figura 1A) de los viales (es decir, 0 h después de la formación del pupario, APF) utilizando fórceps o un pincel fino para desalojar las pupas de la superficie interior del vial y transfiera las pupas cuidadosamente al lado de un vial de plástico limpio y vacío.
   nota: Las larvas errantes del^3er estadio se arrastran hacia arriba fuera del medio alimenticio para someterse a la pupa; Las prepupas blancas recién formadas se identifican fácilmente ya que poseen espiráculos anteriores evertidos y son estacionarias (a diferencia de las larvas de^3er estadio). La cutícula se transforma en el "puparium" (la caja de la pupa), que inicialmente es suave y blanco. Se debe tener cuidado para evitar dañar las pupas, ya que esto puede conducir no solo a una respuesta inflamatoria inducida por lesiones no deseadas, sino también a un retraso significativo en el desarrollo.
5. Envejezcan las pupas seleccionadas hasta la etapa de desarrollo adecuada (18 h APF dará resultados óptimos) en el vial a 25 °C.
   nota: A medida que se desarrollan las pupas, la carcasa de la pupa se volverá progresivamente más oscura y quebradiza.
6. Prepare otros reactivos para el siguiente paso con anticipación. Para hacer el pegamento de heptano, combine una cinta adhesiva de doble cara enrollada de 20 cm de longitud con 20 ml de heptano en un tubo de centrífuga de 50 mL, selle con la película de parafina y cocine a temperatura ambiente durante la noche en el banco.

>2. Preparación y disección de pupas de Drosophila

1. Transfiera las pupas de Drosophila escenificadas a un trozo de cinta adhesiva de doble cara montado en un portaobjetos de vidrio. Coloque las pupas de manera que el lado ventral quede firmemente pegado a la cinta y el lado dorsal hacia arriba (Figura 1B).
   nota: La parte anterior de la pupa será identificable a partir de los dos espiráculos que sobresalen del extremo anterior de la caja de la pupa.
2. Retire cuidadosamente las pupas de su cubierta protectora de pupario bajo un microscopio de disección de campo claro con pinzas y microtijeras (Figura 1B-D).
   1. Inicialmente, se realiza una incisión en la región más anterior del pupario con las pinzas (Figura 1B). Asegúrese de que la caja de la pupa en esta área sea hueca y desprovista de tejido de la pupa porque la pupa se habrá encogido dentro de la caja durante el desarrollo temprano de la pupa.
   2. Después de esta incisión inicial, desgarre o corte cuidadosamente la caja de la pupa en dirección anterior a posterior con pinzas o microtijeras (Figura 1C) hasta que la pupa esté completamente libre de la cubierta marrón opaca y quebradiza (Figura 1D)
      nota: Las pupas en esta etapa son muy frágiles y se debe tener cuidado para evitar perforar la superficie de la pupa; La perforación es obvia ya que la hemolinfa se filtra rápidamente desde el sitio de punción. Las pupas con pinchazos, por pequeños que sean, deben desecharse.
3. Monta las pupas en un plato con fondo de vidrio con pegamento de heptano.
   1. Utilice una punta de pipeta de 20 mL para colocar una gota de 10 mL de cola de heptano preparada previamente (consulte la sección 1.6 anterior) en una línea sobre el plato con fondo de vidrio.
   2. Deje que el pegamento se seque durante 5 segundos antes de transferir las pupas disecadas con cuidado al pegamento de heptano con pinzas (Figura 1E).
   3. Para facilitar las heridas y la obtención de imágenes, alinee las pupas en una fila; se sugieren aproximadamente 5 pupas, pero se podrán manejar más con la experiencia.
      nota: Se recomienda el uso de pegamento de heptano cuando se utilizan sistemas de imagen verticales, pero no es necesario cuando se utiliza un sistema invertido. Si el pegamento crea aberraciones ópticas durante la toma de imágenes, las pupas se pueden colocar directamente sobre el cubreobjetos: la adhesión natural entre el tejido de la pupa y el vidrio será suficiente en la mayoría de los casos para obtener imágenes estables, siempre que se tenga cuidado al mover la antena de imágenes entre microscopios.
4. Para obtener los mejores resultados, monte las pupas de modo que el ala quede plana sobre el cubreobjetos y la mayor parte de la superficie del ala esté en contacto directo con el cubreobjetos (Figura 1F). Haz rodar las pupas con pinzas para cambiar su posición y asegurarte de que el ala esté montada correctamente.
5. Para evitar la deshidratación de la muestra durante el período de imagen, agregue un trozo de papel de filtro absorbente empapado en agua destilada al costado del plato con fondo de vidrio al final del montaje, teniendo cuidado de no tocar las pupas (Figura 1E). Cubra el plato con una tapa.
   nota: Las pupas ya están listas para ser heridas y ser tomadas por imágenes.

>3. Herida inducida por láser en las alas de la pupa de Drosophila

1. Transfiera el plato con fondo de vidrio que contiene las pupas montadas a un microscopio de campo amplio equipado con un sistema de ablación láser sintonizable.
   1. Utilice un láser de ablación bombeado con nitrógeno refrigerado por aire UV pulsado ajustado a 435 nm (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles); el usuario selecciona la longitud de onda precisa de la luz utilizada para la iluminación a través de una celda de tinte adecuada.
2. Usando óptica de campo claro, ajuste los controles de la platina del microscopio para ubicar el ala de la pupa de la primera pupa que se va a herir (Figura 1F).
3. Para obtener resultados óptimos, utilice un lente objetivo de inmersión en aceite de 40X o 63X tanto para la obtención de imágenes como para la ablación con láser; asegúrese de que el líquido de inmersión utilizado (aceite o glicerol) sea consistente entre los sistemas de ablación y obtención de imágenes. Ajuste el microscopio para enfocar el plano del epitelio del ala de la pupa más cercano al cubreobjetos de vidrio (es decir, enfocar la región del epitelio que se va a herir) usando la perilla de control de enfoque fino.
4. Usando los ajustes de la platina del microscopio, coloque el ala de la pupa de modo que el área a herir esté directamente alineada con el área objetivo conocida del láser de ablación.
5. Utilice un portaobjetos atenuador de densidad de energía instalado en el microscopio para ajustar manualmente el nivel de potencia de la luz de ablación.
   nota: El control deslizante del atenuador tiene paradas de clic y rayas para identificar el nivel relativo de atenuación y permitir el uso de ajustes reproducibles.
6. Usando un control de gatillo manual externo, active el láser de ablación con un solo clic breve del gatillo para hacer una herida. Verifique la aparición de la burbuja de aire transitoria en el sitio de la ablación, ya que las heridas normalmente estarán acompañadas de ella. Compruebe si el herido inducido por láser ha sido exitoso utilizando los filtros fluorescentes adecuados para visualizar el epitelio de la pupa.
   nota: Tenga cuidado de evitar la exposición accidental a los rayos láser, ya que los reflejos del haz pueden causar daños graves en los ojos o la piel.
7. Si la herida no tiene éxito, varíe el plano focal (moviendo el foco del microscopio ligeramente por encima o por debajo del nivel focal actual) y repita el disparo de ablación con un solo clic. Alternativamente, aumente gradualmente la potencia del láser utilizando el portaobjetos atenuador hasta alcanzar el tamaño de herida deseado.
8. Para variar la frecuencia de repetición del pulso del láser de ablación, use la perilla de tasa de repetición en el panel de control trasero (que cambia la tasa de menos de 1 pulso/s hasta 60 Hz). Para un herido óptimo, ajuste la frecuencia de repetición de pulsos a 40 Hz.
9. Para generar heridas de diferentes tamaños, utilice el portaobjetos atenuador de densidad de energía para ajustar manualmente el nivel de potencia de la luz de ablación.
10. Abstente de herir a todas las pupas montadas y usa estas pupas no ablacionadas como controles no heridos.
11. Para obtener resultados consistentes, realinee regularmente el sistema de ablación (utilizando el manual de instrucciones correspondiente). Además, limpie y rellene la celda del resonador de tinte que controla la longitud de onda de salida del láser.

4. Imágenes confocales de lapso de tiempo in vivo

1. Transfiera rápidamente el plato con fondo de vidrio a un microscopio apropiado para obtener imágenes de lapso de tiempo.
   nota: Para obtener resultados óptimos, utilice un microscopio confocal o de disco giratorio de alta especificación equipado con detectores sensibles que puedan detectar tanto la proteína verde fluorescente (GFP) como los fluoróforos mCherry.
2. Para obtener imágenes de todo el ala de la pupa, utilice una lente objetivo de bajo aumento (por ejemplo, 20X) (Figura 2A). Para obtener imágenes de la reparación de heridas y la respuesta inflamatoria que la acompaña con alta resolución espacial, utilice las lentes de objetivo de inmersión en aceite 40X (NA 1.3) o 63X (NA 1.4) (consulte las imágenes representativas en la Figura 2B-D).
3. Abra el software de captura de imágenes adecuado asociado con el microscopio.
4. Utilizando el software de captura de imágenes, encienda los láseres adecuados, por ejemplo, los láseres de 488 nm y 561 nm para visualizar los fluoróforos GFP y mCherry, respectivamente (haciendo clic en las casillas correspondientes) y ajuste la potencia del láser y los ajustes de ganancia/compensación para proporcionar suficiente señal fluorescente evitando la saturación de píxeles; utilice la potencia láser más baja posible (en el rango de 5 a 20%) para minimizar el fotoblanqueo y la fototoxicidad.
5. Para capturar tanto el epitelio reparador como el reclutamiento de células inflamatorias, configure el microscopio para registrar una pila z usando las perillas de ajuste de enfoque fino en el panel de control; para obtener resultados óptimos, configure el software (usando clics de botón manuales) para registrar cortes z a través del ala de la pupa (mínimo cada 3 mm), desde la parte superior del epitelio herido hasta el espacio extracelular debajo (que contiene hemocitos migratorios) para lograr una pila z grande (en el rango de 50 a 100 mm).
6. Para imágenes de lapso de tiempo, grabe pilas z a intervalos de tiempo regulares (mínimo cada 30 s) durante al menos 1 h después de la herida.
   nota: El intervalo de tiempo exacto entre las pilas z elegidas representa un equilibrio entre la captura de la dinámica celular que cambia rápidamente y evitar el fotoblanqueo de las muestras.
7. Para obtener imágenes simultáneas de múltiples pupas (incluidos los controles no ablacionados sin heridas), utilice una platina motorizada (conectada al microscopio) y la función de adquisición de múltiples posiciones disponible en el software de imágenes. Establezca manualmente la posición de cada pupa dentro del software usando las perillas de control de posición del escenario y luego configure manualmente los límites de la pila z apropiados (superior e inferior) para cada pupa.
8. Visualice las imágenes de lapso de tiempo durante la captura de imágenes o más tarde con software especializado en análisis de imágenes (como ImageJ) utilizando proyecciones z-stack o renderizado 3D. Por ejemplo, para seguir los movimientos de los hemocitos individuales (como en la Figura 2C' y D'), rastree los núcleos de los hemocitos utilizando los plug-ins de acceso abierto de ImageJ "TrackMate" o "Manual Tracking" (métodos publicados en).
9. Utilice sondas fotoconvertibles (como Kaede) para fotoconvertir y marcar selectivamente un subconjunto de células epiteliales o inmunitarias durante la obtención de imágenes.
   1. Abra los módulos apropiados dentro del software de imagen para realizar la fotoconversión (como el módulo de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) y el módulo de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo) y active el láser de 405 nm (haciendo clic en el cuadro de software correspondiente).
   2. Seleccione las celdas que desea fotoconvertir dentro del software FRAP utilizando la herramienta de selección cuadrada, circular o a mano alzada. Dentro del software FRAP, establezca el curso de tiempo para la fotoconversión (blanqueo) en una sola iteración/fotograma y configure el láser de 405 nm al 20% de potencia láser. Haga clic manualmente en Iniciar el experimento para realizar la fotoconversión.
   3. Salga del módulo FRAP (haga clic en Cerrar) y regrese a la pantalla de imagen original dentro del software; utilice los láseres de 488 nm y 561 nm para obtener imágenes del comportamiento de las células fotoconvertidas y no fotoconvertidas configurando una pila z y una grabación de lapso de tiempo como se >nota: Las sondas fotoconvertidas permanecen estables durante muchas horas después de la fotoconversión inicial, lo que permite seguir el comportamiento de las células fotoconvertidas a lo largo del tiempo (durante al menos 5 h). Por ejemplo, las células inflamatorias de la herida pueden ser fotoconvertidas selectivamente (Figura 2F) y su comportamiento puede seguirse a medida que se resuelven desde el sitio de la lesión (Figura 2G y H).

Results

Figura 1: Preparación de la pupa de Drosophila para heridas e imágenes en vivo. (A) Prepupas blancas de Drosophila recolectadas a las 0 h APF, con el extremo anterior indicado por apéndices respiratorios evertidos (espiráculos). (B) Después de criar pupas blancas 0h APF durante 18 h a 25 °C, el pupario aparece marrón. La disección de la caja de la p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Existencias de Drosophila
E-cadherina ubicua marcada con GFP; Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)	Centro de Stock de Kioto, DGRC	#109007	Las secuencias promotoras de Ubi-p63E impulsan la expresión de Drosophila E-cadherina (escopeta) marcada en el extremo C-terminal con GFP.
E-cadherina ubicua marcada con GFP; Ubi-p63E-shg.GFP (III)	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universidad de Indiana)	#58742	Las secuencias promotoras de Ubi-p63E impulsan la expresión de Drosophila E-cadherina (escopeta) marcada en el extremo C-terminal con GFP.
Moesin P{sGMCA}3.1 ubicuo etiquetado con GFP	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universidad de Indiana)	#59023	El promotor/potenciador sqh expresado de forma ubicua impulsa la expresión de un fragmento de Moesin (que incluye las secuencias de unión a actina) marcado con GFPS65T.
Conductor de serpiente-Gal4 específico del hemocito; SRP-GAL4;	Generado por Katja Bruckner	Generado por Katja Bruckner	La expresión de Scer\GAL4 fusionada a una cola de poliA está controlada por 2 secuencias genómicas de la serpiente Drosophila. Árbitro: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. El receptor PDGF/VEGF controla la supervivencia de las células sanguíneas en Drosophila. Célula de desarrollo. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP w1118;; P{UAS-RedStinger}6	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universidad de Indiana)	#8545 o #8547	Las secuencias reguladoras de UAS impulsan la expresión de la forma DsRed.T4 de RFP que se etiqueta en el extremo C-terminal con una señal de localización nuclear
UAS-citoplasmaGFP ;; P{UAS-GFP. S65T}	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universidad de Indiana)	Múltiples existencias disponibles (por ejemplo, #1522)	Expresión de la versión S65T de GFP por secuencias reguladoras de UAS; la variante S65T exhibe un mayor brillo.
UAS-fotoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universidad de Indiana)	#26161	La proteína Kaede emite fluorescencia verde brillante después de la síntesis, pero cambia de manera eficiente a una fluorescencia roja brillante y estable en la irradiación con UV.
calabaza espagueti etiquetada con GFP w1118; P{sqh-GFP.RLC}	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universidad de Indiana)	#57145	La región de codificación sqh, que se marca en el extremo C-terminal con una etiqueta T:Avic\GFPS65T, se expresa bajo el control del promotor sqh natural.
Ingredientes para los medios de alimentación para moscas			Los medios de alimentación para moscas se fabrican de acuerdo con procedimientos estándar (véase Greenspan, R. 1997. Empuje de moscas: la teoría y la práctica de la genética de Drosophila. Cold Spring Harbor Press. 1-191 págs.)
maíz	Wild Oats, Bristol, Reino Unido (o proveedor equivalente)	Póngase en contacto directamente con el proveedor	orgánico
Harina de soja	Wild Oats, Bristol, Reino Unido (o proveedor equivalente)	Póngase en contacto directamente con el proveedor	orgánico
Extracto de malta	Wild Oats, Bristol, Reino Unido (o proveedor equivalente)	Póngase en contacto directamente con el proveedor	orgánico
melaza	Wild Oats, Bristol, Reino Unido (o proveedor equivalente)	Póngase en contacto directamente con el proveedor	orgánico
Agar Difco	BD Biosciences, Fisher Scientific	DF0142-15-2	Para la preparación de alimento para moscas
Ácido propiónico	sigma	402907	Para la preparación de alimento para moscas
Nipagen	sigma	79721	Para la preparación de alimento para moscas
Levadura de panadería deshidratada	Redstar, Dutscher Scientific, Reino Unido Ltd	Redstar, Dutscher Scientific, Reino Unido Ltd	Para la preparación de alimento para moscas
Preparación y montaje de muestras
Parafilm	sigma	P7793-1EA	Para la preparación de cola de heptano
Pincel de marta fina	Daler-Rowney (o equivalente)	#0 o 1
fórceps	Fisher Scientific (o Herramientas de Bellas Ciencias)	NC9404145	Dumont #5
Platos con fondo de vidrio para la toma de imágenes	MatTek	P35G-0-10-C	Sugerimos usar placas de Petri de 35 mm, con al menos un micropocillo de 10 mm, 0,085-0,13 mm de vidrio de cobertura, sin recubrimiento. Las placas con micropocillos más grandes permitirán montar y obtener imágenes de un número cada vez mayor de pupas en un solo experimento.
heptano	sigma	51730-5ML	Para la preparación de cola de heptano
Cinta adhesiva de doble cara (por ejemplo, Scotch)	Agar Científico	AGG263	Para la preparación de cola de heptano
Tubo de 50 ml (para pegamento de heptano)	Tubos Falcon de Fisher Scientific	Teléfono 14-432-22	Para la preparación de cola de heptano
Portaobjetos de microscopio de vidrio	Agar Científico	AGL4244	Para la disección de pupas de Drosophila
Microscopio estereoscópico de disección con campo claro	Leica (o equivalente)	M50	Para la disección de pupas de Drosophila
Microtijeras	John Weiss Internacional	103123	Tijeras de investigación en miniatura (rectas)
Ablación láser e imágenes
Láser de ablación nitógena	Espectro-Física (o equivalente de Andor)	Modelo VSL-337ND-S	En el caso de las heridas, debe estar conectado a un sistema de imágenes de campo amplio
Microscopio de barrido láser confocal multiláser (CLSM)	Leica (o equivalente)	TCS AOBS SP8 o SP5-II acoplado a un microscopio de epifluorescencia invertida Leica DMi8 (o equivalente)	Lo ideal es incluir una platina motorizada para el escaneo multisitio y en "mosaico", además de detectores GaAsP "híbridos" (que ofrecen una sensibilidad mucho mayor y un aumento de la señal baja)
Cámara ambiental	Servicios de Life Imaging (o equivalentes)	"Sistema de control de temperatura del microscopio"	Acoplado al microscopio confocal para el control de la temperatura durante la obtención de imágenes
Software de análisis de imágenes
Módulo de software FRAP	Leica (o equivalente)	Módulo de software CLSM FRAP	Para realizar la fotoconversión de fluoróforos fotoconvertibles como Kaede
ImageJ (software de análisis de imágenes)	Institutos Nacionales de la Salud (NIH, por sus siglas en inglés)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 años de análisis de imágenes". Métodos de la Naturaleza 9, 671-675, 2012.
Plugin de ImageJ "Seguimiento manual"	Institutos Nacionales de la Salud (NIH, por sus siglas en inglés)	https://imagej.net/Manual_Tracking
Complemento de ImageJ "TrackMate"	ImagenJ, Institutos Nacionales de Salud	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY.; Perry, N. y Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: Una plataforma abierta y extensible para el seguimiento de partículas individuales", Métodos 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (software de imágenes 3D de alto rendimiento)	Perkin Elmer	Volocity 6.3	Para el análisis de imágenes
IMARIS (software de análisis de imágenes)	Plano de bits	IMARIS para Biólogos Celulares	Para el análisis de imágenes