$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Titulación de virus
>NOTA: Dependiendo del número de virus y del número de duplicados, se puede configurar una placa de pocillos con las siguientes flexibilidades: (1) La dilución viral puede disponerse a lo largo de las filas o de las columnas (Figura 1). Cada virus debe ocupar una fila/columna separada. (2) El incremento de dilución viral es flexible, pero debe comenzar con la concentración viral más alta en la esquina superior izquierda. (3) No hay restricción en el número de duplicados.
- Alícuota suficientes células MDCK o células MDCK-SIAT8 en placas de 96 pocillos (200 μl/pocillo). Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 o 3 días para alcanzar la confluencia. Propagar las células en DMEM suplementado con un 10% de suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor y antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina). Incubar las células SIAT a 37 °C con 5% de CO2 y 1 mg/ml de sulfato G418.
nota: El factor de dilución depende de la experiencia y de la línea celular utilizada. La monocapa celular debe ser confluente (es decir, sin pared celular ni contorno visible para las células MDCK y un diseño apretado para las células MDCK-SIAT1) en el momento de la inoculación del virus. En la Tabla 1 se dan ejemplos de diluciones basadas en el subcultivo de matraces confluentes de células MDCK o MDCK-SIAT1.
- Lave las células 3 veces con 200 μl de medio de crecimiento viral (VGM) por pocillo. Esterilice la lavadora de placas multicapa con 70% de EtOH durante 30 minutos y, a continuación, enjuáguela con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) o VGM antes del lavado.
- Aspire el VGM y añada inmediatamente 50 μl de VGM a cada pocillo.
- Añada 900 μl de VGM a cada uno de los 6 tubos estériles (o menos, dependiendo del número de virus de prueba y duplicados). Pipetear 100 μl de virus en el primer tubo, mezclar bien y diluir en serie, cambiando las puntas entre cada dilución. Repita el procedimiento para cada virus que se va a valorar.
nota: Esto dará diluciones de virus de 10-1 a 10-6.
- Agregue 50 μl de cada dilución de virus, comenzando por la dilución más alta (1 x 10-5 en la Figura 1), a los pocillos duplicados (Columnas 9 y 10 en la Figura 1) de una placa de 96 pocillos.
- Coloque la placa a 37 °C durante 2-3 horas para permitir que el virus infecte las células><.
nota: Es necesaria una incubación de 2 a 3 horas para garantizar que los virus del inóculo tengan tiempo suficiente para llegar a la monocapa.
- Prepare la capa superpuesta (10 ml/plato)
nota: El recubrimiento consta de 5 ml de 2x DMEM, tripsina (concentración final de 2 μg/ml), 20 μl de caldo de 1 mg/ml y 5 ml de linters de algodón celulósico (consulte la lista de materiales).
- Retira el inóculo.
- Agregue la superposición (200 μl a cada pocillo). Incubar durante la noche a 37 °C, SIN PERTURBACIONES.
nota: La gemación del virus tiene lugar después de aproximadamente 4 horas, por lo que es importante que la placa no se altere después de este tiempo.
- Aspire el recubrimiento de los pozos.
- Agregue paraformaldehído al 4% helado en PBS A (200 μl/pocillo). Colóquelos a 4 °C durante 30 min o a temperatura ambiente durante 20 min.
NOTA: PBS A es solución salina tamponada con fosfato de pH natural con 10 g de NaCl, 0,25 g de KCl, 1,437 g de Na2HPO4, 0,25 g de KH2PO4 y 1 L de agua destilada (consulte la Lista de materiales)
NOTA: El paraformaldehído es dañino cuando se inhala y puede causar quemaduras si se ingiere. También hay pruebas limitadas de un efecto cancerígeno y puede causar sensibilización después del contacto con la piel.
- Aspirar el paraformaldehído y lavar las placas dos veces con PBS A (200 μl/pocillo).
- Guarde las placas en PBS A a 4 °C para su uso futuro, o continúe con los siguientes pasos.
- Añadir tampón de permeabilización (100 μl/pocillo). Déjalo a temperatura ambiente durante 30 min.
- Lave la placa dos veces con PBS A (200 μl/pocillo).
- Añadir 50 μl del primer anticuerpo, MAb de ratón contra la gripe tipo A (1:1.000 en tampón ELISA), por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora (o 4 °C durante la noche), agitando.
- Lavar 3 veces en 100 μl de tampón de lavado (0,05% Tween 80 en PBS A, v/v) por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min entre lavados. Alternativamente, lávelo 3 veces sin incubar usando 300 μl por pocillo.
- Añadir 50 μl del segundo anticuerpo, conjugado HRP (H+L) anti-ratón de cabra (1:1.000 en tampón ELISA), por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora, agitando.
- Lávelo 3 veces como se describe en el paso 1.17.
- Añadir el sustrato (50 μl/pocillo). Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos o hasta que el desarrollo de un color azul sea claramente visible.
- Para detener la reacción, lavar la placa dos veces con 200 μl de agua destilada por pocillo, incubando a temperatura ambiente durante 2 -3 min entre los lavados.
- Seque el plato al aire y guárdelo en un lugar oscuro (por ejemplo, envuélvalo en papel de aluminio).
>2. Neutralización de virus
NOTA: Calcule el número de placas necesarias para el ensayo de neutralización. Cada placa puede contener un virus y varios antisueros.
NOTA: Dependiendo del número de antisueros y del número de duplicados, se puede configurar una placa de pocillos con las siguientes flexibilidades: (1) La dilución del suero puede disponerse a lo largo de una fila o una columna (Figura 2). Cada suero debe ocupar una fila o columna separada. (2) El incremento de la dilución sérica es flexible, pero debe comenzar con la concentración sérica más alta en la esquina superior izquierda de una placa. (3) El número de duplicados equilibra el número de antisueros. Más duplicados pueden ayudar a suavizar las variaciones experimentales. (4) El número de VC y el número de duplicados de control de celda (CC) son flexibles, pero también deben estar en filas o columnas separadas. Se espera que el número de duplicados de VC sea significativamente mayor que el de los antisueros.
- Prepare la monocapa de celda, como en los pasos 1.1-1.3, con 2 o 3 días de anticipación.
- Agregue 50 μl de VGM a cada pocillo de la placa.
- Utilice las columnas 11 y 12 para VC y CC, respectivamente. Añada 50 μl de alícuotas de suero tratado con enzima destructora de receptores (RDE) 1:20 a la primera fila (A) de las columnas 1-10.
nota: Para cada combinación de virus y suero, el ensayo se realiza por duplicado, por lo que una placa puede, por ejemplo, contener un virus probado contra cinco antisueros.
- Realice diluciones en serie de 2 veces transfiriendo 50 μl de la fila A a la fila H (columnas 1-10 en la figura 2) y descartando 50 μl de la fila H.
- Agregue 50 μl de diluyente a cada pocillo de la columna CC (columna 12 en la Figura 2).
- Agregue 50 μl del virus a cada pocillo de la placa, excepto para la columna CC (Columnas 1-11, Filas A-H en la Figura 2).
- Incubar a 37 °C durante 2-3 h. Retirar el inóculo. Agregue la capa superior (200 μl) a cada pocillo. Incubar durante la noche a 37 °C, sin perturbaciones. Fije y tiña las placas como para la valoración del virus (pasos 1.11-1.22).
>3. Cuantificación de la neutralización
- Coloque una placa de pocillo en el área de escaneo de un escáner plano, como se muestra en la Figura 2a. Utilice el límite de posición en forma de L para garantizar una ubicación de imagen óptima y repetible.
nota: Es posible obtener imágenes de dos placas de pocillos en un escaneo.
- Escanea la placa.
- Ejecute el software "Wellplate Reader" para calcular los títulos virales requeridos (Figura 3).
- Haga clic en el botón "Cargar imagen" para cargar una imagen. Deslice la barra roja en "Umbral global" para ajustar el umbral de muestreo. Haga clic en el botón "Actualizar" para examinar el efecto.
- Marque la casilla "Calcular neutralización/valoración". Haga clic en el botón "Muestreo" para cuantificar el ICP. Haga clic en el botón "Guardar" para guardar los resultados del muestreo cuando se le solicite.
nota: Después del proceso de muestreo, aparece automáticamente una nueva ventana llamada "Cálculo de neutralización y valoración" si la casilla "Calcular neutralización/valoración" está marcada.
- Cargue o ingrese el mapa de la placa del pozo. Indique el umbral (por ejemplo, 50%) en "Neutralización: deducción de infección (%)".
- Seleccione "Proceso de neutralización" para calcular los títulos. Verifique los títulos y haga clic en el botón "Guardar y cerrar" para guardar los resultados de la neutralización.
nota: La neutralización se informa como el recíproco de la dilución más alta del suero con la reducción predefinida de ICP (como 50% u 80%) contra la VC (la media de la Columna 11 en la Figura 4. Se utilizó una reducción del 50% del PIC en los Resultados Representativos.
