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1. Código de barras de las células sanguíneas lisadas/fijadas
- Descongele lentamente las muestras de células lisadas/fijas del almacenamiento a -80 °C en hielo; se pueden etiquetar un máximo de 20 muestras con códigos de barras únicos y agruparlas utilizando este sistema. Diluya el tampón permanente de código de barras 10X en 1:10 con PBS; haga suficiente tampón para ~ 3 mL por muestra.
- Llene un comedero no estéril con el CSM y otro con el tampón permanente de código de barras 1X. Añada 1 ml de CSM helado a las muestras recién descongeladas, mezcle bien con una pipeta y transfiéralo a los respectivos tubos de grupo de polipropileno preetiquetados.
- Tome una muestra de 10 μL para contar las células utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro. Normalice los recuentos de células a 1,5–2 x 106 células por muestra en cada tubo de racimo: retire y deseche el volumen de células sobrantes por encima de 2 x 106 células.
- Centrifugar las celdas a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en 1 mL de tampón permanente de código de barras 1X con una pipeta multicanal y una centrífuga a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante.
- Alinee los tubos del grupo en una rejilla en el mismo orden que se indica en la clave del código de barras para que la muestra coincida con su código de barras. Añada 800 μL de tampón permanente con código de barras 1X mediante pipeta multicanal a todas las muestras de los tubos del clúster sin tocar el pellet de la célula con las puntas de la pipeta (sin mezclar) para reducir la pérdida de células. Deje a un lado la rejilla con los tubos del racimo.
- Retire las tiras de tubo del kit de códigos de barras Pd de 20 plex a -20 °C y descongele a temperatura ambiente. Agregue 100 μL de tampón permanente de código de barras 1X, mezcle bien y transfiera 120 μL de la mezcla de código de barras resuspendida a las muestras de celdas correspondientes en los tubos del clúster.
- Mezcle a fondo con una pipeta multicanal para que no haya contaminación cruzada entre las muestras con códigos de barras individuales. Incube los tubos de racimo durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que los códigos de barras etiqueten las células.
- Centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante, luego vuelva a suspender en 1 mL de CSM.
- Centrifugar y resuspender en CSM de nuevo.
nota: Cada muestra ahora está etiquetada con un código de barras único, y las muestras están listas para ser agrupadas.
- Centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Con una sola pipeta y utilizando la misma punta, transfiera todos los gránulos de celdas con un volumen residual de ~70-80 μL a un tubo de poliestireno. NO expulse la punta de la pipeta; Deje a un lado la pipeta única con esta punta.
- Con una pipeta multicanal y nuevas puntas, agregue ~100 μL CSM a cada tubo de clúster original para maximizar la recuperación celular. Con la pipeta única con la punta que se reservó, transfiera todos los gránulos de celda en un volumen residual de ~100 μL al mismo tubo de poliestireno.
- Agregue CSM para completar el tubo de poliestireno (~ 3 mL). Cuente y registre el número de celda del conjunto de códigos de barras agrupados. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Proceda a teñir las muestras con código de barras el mismo día.
Nota: Es normal esperar una pérdida de celdas de ~20-30% en el proceso de código de barras.
>2. Tinción de células sanguíneas lisadas/fijadas con código de barras y preparación para el análisis en un instrumento de citometría de masas
>Nota: Cada título 1X de anticuerpo de tinción (1 μL de anticuerpo por reacción de tinción de 100 μL), generalmente puede teñir 3-4 x 106 células. Por lo tanto, cuando todas las muestras con código de barras se agrupan en un tubo, se debe aumentar la cantidad de anticuerpos. Si 20 muestras con código de barras equivalen a 30 x 106 células, y cada título 1X puede teñir 3-4 x 106 células, la muestra con código de barras solo requiere un título 10X, en lugar de teñir cada muestra individualmente, lo que requeriría una cantidad 20X de anticuerpo (1X por tubo individual). La concentración del anticuerpo en relación con el número de células debe valorarse cuidadosamente para cada cóctel de anticuerpos individual (no se discute aquí).
- Teñir las células con anticuerpos (Tabla de Materiales) para la tinción de superficies y la inducción de citocinas.
- Realice el cóctel de tinción de superficie calculando la cantidad que se agregará y teniendo en cuenta el error de pipeteo (es decir, si se tiñen 20 muestras con código de barras de 2 x 106 celdas en cada muestra, se requiere una tinción de título de 10X; para los cálculos de volumen final, compense el error de pipeteo haciendo una solución de tinción final de 10.5X).
- Agregue 10 veces más volumen de tinción de superficie al pellet de celda con código de barras. Para reducir la pérdida de células, con la misma punta, mezcle y mida el volumen de las manchas superficiales y los gránulos de células.
- En función del volumen de células y del cóctel de tinción, agregue CSM a un volumen de tinción final de 50 μL por número de muestras de células (es decir, si se ejecuta un conjunto de 20 muestras, 50 μL X 20 = 1 mL). Incubar durante 30 min a 4 °C. Agitar la muestra cada 15 min para favorecer una tinción uniforme.
- Durante la incubación de la mancha superficial, prepare el tampón de permeabilidad/lavado (Tabla de materiales) diluyendo 1:10 con ddH2O. Prepare volúmenes de 2 mL para la permeabilización y 5 mL para el lavado. Mantener a 4 °C o en hielo.
- Rellene el tubo de tinción de superficie con CSM y centrifugue a 600 x g a 4 °C durante 5 min. Aspire el sobrenadante. Vuelva a suspender la muestra con código de barras en 2 mL de tampón Perm/Wash de dilución 1:10 a 4 °C. Incubar a 4 °C durante 20-30 min para permeabilizar completamente las células.
- Centrifugar a 600 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar el sobrenadante.
- Para la tinción intracelular, siga pasos de tinción similares (como para la tinción de superficies). Sin embargo, utilice el tampón Perm/Wash de dilución 1:10 a 4 °C en lugar del CSM para aumentar el volumen total de tinción, de modo que las células permanezcan en un entorno permeabilizante durante toda la tinción intracelular.
- Agregue el cóctel de anticuerpos intracelulares a la superficie teñida y permeabilizada en el gránulo de células (pasos 2.1.2-2.1.7). Lleve el volumen total de tinción a 50 μL por número de muestras de células. Incubar durante 60 min a 4 °C. Agitar la muestra cada 15 min para asegurar una tinción uniforme.
- Durante la tinción intracelular, prepare la solución intercaladora: 900 μL de PBS filtrado + 100 μL de PFA filtrado al 16% (concentración final de PFA al 1,6%) + 0,2 μL de 500 uM de colorante intercalador (Tabla de Materiales).
- Rellene el cóctel de gránulos de células + anticuerpos intracelulares con tampón frío 1:10 Perm/Wash.
- Centrifugar a 600 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Rellene el tubo de tinción con CSM. Cuente y registre el número de celular. Centrifugar a 600 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 1 mL de solución intercaladora del paso 4.9. Incubar durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente para una intercalación completa o durante la noche a 4 °C (las muestras en la solución intercaladora pueden permanecer a 4 °C hasta 1 semana antes de ejecutarlas en el instrumento de citometría de masas).
- Preparar las células para el instrumento de citometría de masas.
- Rellene el tubo con 3 mL de ddH2O filtrado y centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células en 3 mL de ddH2O filtrado. Pase esta suspensión a través de un filtro de 100 μm para eliminar cualquier residuo o agregado que pueda obstruir el instrumento de citometría de masas.
- Cuente y registre el número de celda después de la filtración. Centrífuga a 600 x g durante 5 min a 4 °C
- Prepare la solución de perlas de calibración (Tabla de Materiales) diluyéndola 1:10 en ddH2O.
- Vuelva a suspender las células teñidas en el volumen requerido de solución de perlas de calibración diluida 1:10 para alcanzar una concentración de células de ~1 x 106 células/mL.
nota: Para un CyTOF1 a 45 μL/min, el óptimo recomendado es 5 x 105 células/mL; para Helios a 30 μL/min, 7,5 x 105 células/mL.
- Proceda a ejecutar la muestra en el instrumento de citometría de masas.