Detección de proteínas priónicas anormales en el tejido cerebral mediante inmunohistoquímica

Abstract

Fuente: Orge, L., et al. Detección de proteínas priónicas anormales por inmunohistoquímica. J. Vis. Exp. (2023).

Este video muestra una técnica para detectar proteínas priónicas mal plegadas en secciones del cerebro utilizando inmunohistoquímica. Al tratar la sección del cerebro con ácido fórmico para desnaturalizar los priones y minimizar el riesgo de infección, así como al desenmascarar los agregados de priones mediante la recuperación de epítopos inducida por el calor, las secciones se inmunomarcan para los agregados de proteínas priónicas mal plegadas y se observan bajo un microscopio.

Protocol

1. Seccionamiento de tejidos y preparación de portaobjetos

1. Corte secciones de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) de 3-5 μm de espesor utilizando un micrótomo.
2. Flotar secciones sobre agua purificada a una temperatura de aproximadamente 10 °C por debajo del punto de fusión de la parafina utilizada. Levante las secciones del agua y colóquelas en portaobjetos de microscopio especialmente tratados (consulte la tabla de materiales). Deje que el agua se drene completamente de los toboganes.
3. Incubar los portaobjetos durante la noche a 50 °C para mejorar la adherencia de los tejidos.
   nota: Es preferible preparar los tejidos recién seccionados para los protocolos de IHQ, aunque las secciones de control positivas y negativas de la EET pueden prepararse con anticipación y almacenarse. Los pasos 2 a 4 deben realizarse en una campana de gases químicos.

>2. Desparafinación y rehidratación

1. Coloque los portaobjetos con las secciones de tejido en una cesta de tinción de acero inoxidable (consulte la tabla de materiales). Sumerja la cesta en un baño de xileno (recipiente de tinción de acero inoxidable) durante 3 minutos, retire y sumerja una vez más.
2. Retire el xileno y rehidrate las secciones sumergiéndolas en un baño de etanol absoluto durante 3 min. Retire y sumerja una vez más.
3. Seque las secciones al aire y colóquelas en un baño de etanol al 90% durante 1 min. Transfiera a un baño de etanol al 70% durante otro minuto, seguido de una transferencia final a un baño de etanol al 50% durante 1 min. Para cada tratamiento de baño de etanol, agite suavemente la cesta deslizante dos veces y drene la cesta antes de la próxima transferencia.

>3. Recuperación de epítopos

1. Sumerja cuidadosamente las secciones de papel en ácido fórmico al 98% a temperatura ambiente durante 30 min. Enjuague las secciones en agua del grifo durante 5 min, seguido de enjuague dos veces en agua destilada.
   cautela: El ácido fórmico es altamente corrosivo. Se deben usar gafas protectoras y guantes.
2. Realice la recuperación de antígenos inducida por calor (HIER) siguiendo los pasos a continuación.
   nota: Este paso se realiza mediante autoclave hidratado a 121 °C durante 30 min en una cámara de presión específica (ver Tabla de Materiales).
   1. Precalentar el tampón de citrato (10 mM, pH 6,1, ver Tabla de Materiales) a 98 °C durante unos 20 min en un recipiente de tinción de acero inoxidable colocado dentro de la cámara de presión lleno de 500 mL de agua destilada.
      nota: Para el presente estudio, el Punto de Ajuste del programa fue 1 (SP1) para el equipo específico utilizado.
   2. Después de que la alarma indique que el equipo alcanzó el tiempo y la temperatura programados, sumerja la canasta con correderas e inicie el programa hasta el punto de ajuste 2 (121 ° C durante 30 min). Para fines de control de calidad, coloque una sección de cinta indicadora de autoclave adhesiva en la canasta para monitorear la temperatura y la presión, y registre la presión inicial y final de este programa.
   3. Si el número de portaobjetos que se van a inmunoteñir no alcanza la capacidad de la cesta, utilice portaobjetos limpios y en blanco para ocupar las posiciones vacías. Una vez finalizado el programa, permita el retorno pasivo de la cámara a la presión ambiente (al menos 30 min).
      nota: Las duraciones más largas pueden reducir las tinciones de fondo inespecíficas.
   4. Transfiera con cuidado la canasta deslizante a un recipiente de tinción de acero inoxidable lleno de agua destilada durante 5 minutos.

>4. Inactivación de la peroxidasa endógena

1. Sumerja la cesta de portaobjetos que contiene las secciones de muestra en un baño de peróxido de hidrógeno al 3% (H₂O₂) en metanol durante 30 min. Enjuague las secciones con agua corriente (5 min). Drene y sumerja las secciones en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 5 minutos más.

>5. Inmunodetección

NOTA: Para el presente estudio, la inmunodetección se llevó a cabo utilizando el formato de espacio capilar utilizando un sistema de ensamblaje de clip deslizante disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales). También son aplicables otros sistemas de portaobjetos de inmunohistoquímica.

1. Coloque cada portaobjetos en un soporte de placa de cubierta disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales) prehumedecido con TBS, evitando burbujas, con el lado del pañuelo hacia el soporte y los bordes de la corredera coincidiendo con los dos puntos inferiores del soporte.
   1. Sostenga el conjunto del portaobjetos entre el pulgar y el índice, con un dedo encima del portaobjetos de muestra y el otro en la parte inferior del soporte. A continuación, coloque el ensamblaje en la galería del sistema.
   2. Para asegurarse de que el conjunto esté bien ensamblado, llene el pocillo entre el portamuestras y el soporte con TBS, que no debe desbordarse inmediatamente. A partir de este momento, asegúrese de que se deben retener aproximadamente 80 μL de TBS entre el soporte y el portaobjetos. No permita que las secciones se sequen.
2. Una vez en el sistema, para disminuir la tinción de fondo antes del tratamiento con anticuerpo primario (anticuerpo contra proteínas priónicas (anti-PrP), ver Tabla de Materiales), preincube los portaobjetos de muestra con un 20% de suero normal de la misma especie que el huésped del anticuerpo secundario que se utiliza para la inmunotinción (en el presente caso, suero de caballo) durante 30 min en TBS.
3. Descongele el número de alícuotas de anticuerpo que se utilizarán de acuerdo con la especie animal bajo análisis, el número de secciones de muestra que se examinarán y la cantidad de dilución de trabajo.
   nota: Para obtener los mejores resultados, use suero normal al 10% de la misma especie que la fuente del anticuerpo secundario y soluciones de anticuerpos primarios. Si es posible, para obtener los mejores resultados, la fuente huésped del suero normal y del anticuerpo secundario debe ser de la misma especie.
4. Sin lavar las secciones, aplique la solución de anticuerpo primario directamente (200 μL) en cada pocillo del juego de portaobjetos e incube durante 60 min a temperatura ambiente.
5. Para el lavado, llene los pocillos de los juegos de portaobjetos con TBS y espere 5 min. Repita dos veces.
6. Diluir el anticuerpo secundario biotinilado (Horse Ab monoclonal antimurino, ver Tabla de Materiales) a 1/200 en TBS con suero de caballo al 10%. Preparar el volumen requerido en función del número de tramos a tratar.
7. Aplique la solución de anticuerpos secundarios (200 μL) a cada pocillo del juego de portaportaobjetos. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
8. Lavar como se describe en el paso 5.5.
9. Para la incubación con peroxidasa compleja avidina-biotina (complejo ABC/HRP, ver Tabla de Materiales), prepare el reactivo 30 min antes de su uso. Aplique la solución compleja ABC/HRP (200 μL) en cada pocillo del juego de soportes de placa deslizante. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
10. Lavar como se describe en el paso 5.5.

>6. Desarrollo con cromógeno 3,3' diaminobenzidina (DAB)

>PRECAUCIÓN: El DAB es un carcinógeno potencial. Como resultado, es necesario tener un cuidado adecuado al trabajar con este reactivo, incluida la protección ocular, las batas de laboratorio, los guantes y buenos procedimientos de laboratorio. Deseche siguiendo las regulaciones locales.

1. Diluya el cromógeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales) inmediatamente antes de usar. Aplique la solución de cromógeno (400 μL) a cada pocillo del juego de placas deslizantes.
2. Incubar hasta 30 minutos a temperatura ambiente. En las secciones positivas de PrP^Sc (isoforma anormal de proteínas priónicas), un período de incubación de 10 minutos suele ser suficiente.
3. Elimine la solución de cromógeno residual lavando los portaobjetos con agua destilada. Retire los portaobjetos de los soportes de la placa de cubierta y colóquelos en un recipiente de plástico con agua destilada.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanol absoluto	Labchem	LB0507-9010	Sin diluir
			Diluido al 90%, 70% y 50% en agua destilada
Complejo avidina-biotina y peroxidasa Vectastain Elite ABC kit Peroxidasa	Laboratorios de vectores	PK-6100	Prepare y mezcle suavemente 30 minutos antes de usar de acuerdo con las instrucciones del kit. No mezclar después de reposar.
Anticuerpo secundario biotinilado (IgG H+L anti-ratón de caballo)	Laboratorios de vectores	BA-2000-1.5	Diluir a 1/200 en TBS con un 10% de suero normal de caballo. Prepare el volumen requerido en función del número de secciones.
Cromógeno Diaminobencidina-DAB, kit de sustrato, Peroxidasa	Laboratorios de vectores	SK-4100	Prepare antes de usar de acuerdo con las instrucciones del kit. Utilice 400 μL de solución por sección.
Cámara de presión DakoCytomation Pascal	DAKO	S2800
Hematoxilina de Ehrlich:
Etanol absoluto	Labchem	LB0507-9010
Ácido acético glacial	Merck	101830
Alumbre potásico	Merck	1.01047.1000
Glicerina	Merck	1.04091.1000
Solución de bloque de peroxidasa endógena (concentración al 3% H2O2):			40 mL de peróxido de hidrógeno (30% p/p) en 360 mL de metanol. Preparar antes de usar
Peróxido de hidrógeno (30% p/p)	Scharlau	HI0136
metanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Ácido fórmico 98%	Merck	1.00264.1000	Sin diluir
microtomo	Shandon-AS325	microtomo	Shandon-AS325
Suero normal (20%) solución de bloqueo en TBS: Suero normal de caballo	Gibco	16050-122	Prepare el volumen final de acuerdo con el número de secciones del ensayo (200 μL de solución por sección).
Anticuerpo primario anti-PrP Ratón MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovinos, incluyendo tembladera atípica, cervino, felino. No apto para bovinos. De acuerdo con el número de secciones en el ensayo (200 μL de solución por sección) y la dilución del anticuerpo, prepare el volumen final en TBS suplementado con 10% de suero normal de la especie en la que se crió el anticuerpo secundario (suero normal de caballo) Dilución habitual de anticuerpos: MAb 2G11 1/100, pero se debe establecer una dilución de trabajo en cada nuevo lote para obtener la concentración que proporcione el etiquetado más fuerte con el fondo más bajo. Para el almacenamiento, congele volúmenes alícuotas de un mínimo de 10 μL en microtubos estériles. Descongele y use una alícuota a la vez.
Anticuerpo primario anti-PrP Ratón MAb 12F10	Compañía Química de las Islas Caimán	189710	PrP142-160 Bovino, no apto para ovinos Dilución habitual de anticuerpos: 1/200, pero también se debe establecer una dilución de trabajo. Prepárese como MAb 2G11
Cámara Shandon CoverplateTM	Termo Científico	72110017
Centro de inmunización Shandon Sequenza®	Termo Científico	73300001
Shandon Sequenza® Bastidor portaobjetos inmunizante	Termo Científico	73310017
Tampón de citrato en solución (10 mM pH 6,1):			2,55 g de citrato trisódico dihidratado y 0,255 g de ácido cítrico en un litro de agua purificada. Ajuste el pH de la solución de trabajo a 6,1 utilizando 10 mM de solución de ácido cítrico (1,05 g de ácido cítrico en 500 mL de agua purificada) Prepárese el día del ensayo.
Citrato trisódico dihidratado	Sigma-aldrich	S4641-500G
ácido cítrico	Sigma Aldrich	C0759
Tarro y cesta para manchar	Deltalab	Año 19360
		Año 19361
Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus	VWR	631-0108
Solución salina tamponada (TBS) (50 mM DE BASE TRIZMA; 0,8% NaCI; pH 7,6):			10xTBS (solución madre 0,5 M BASE TRIZMA; 8% NaCI; pH 7,6): TRIZMA BASE 60,57 g y NaCl 80 g en 800 mL de agua purificada. Ajustar el pH de la solución madre con ácido clorhídrico al 37% y el volumen final a un litro con agua purificada (mantener 5± 3 °C hasta 2 meses) Diluya la solución madre TBS 1/10 el día del ensayo.
BASE TRIZMA	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Cloruro de sodio (NaCl)	Merck	106404
xileno	Reactivos Panreac Applied Chem ITW	251769	Sin diluir