Un método basado en inmunofluorescencia para cuantificar el estrés de replicación en células cancerosas

Resumen

Fuente: Ramakrishnan, N. et al., Cuantificación del estrés de replicación en células de cáncer de ovario mediante inmunofluorescencia de ADN monocatenario.J. Vis. Exp. (2023)

El video demuestra un enfoque basado en inmunofluorescencia para cuantificar el estrés de replicación en células cancerosas. Las células tratadas con hidroxiurea producen ADN monocatenario, detectado a través de inmunofluorescencia. El recuento de focos de fluorescencia verde indica el nivel de estrés de replicación en las células cancerosas.

Protocolo

NOTA: La línea celular de cáncer de ovario, OVCAR3, se utilizó en estos pasos, pero este protocolo es ampliamente aplicable a muchas otras líneas celulares, incluidas las derivadas de fuentes no ováricas. En la Figura 1 se muestra un esquema del protocolo.

1. Enchapado de las células

1. Haga cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina.
   1. Agregue cubreobjetos de 12 mm de diámetro esterilizados en autoclave a un tubo cónico de 50 mL con solución de poli-L-lisina, y colóquelos en un balancín durante 15 min.
   2. Aspire la solución en una campana de cultivo de tejidos. La....

Resultados

Figura 1: Esquema de etiquetado de IdU.Las células se pulsan con IdU para dos duplicaciones de población. Si se necesita algún tratamiento farmacológico, debe administrarse después de que la primera población se duplique en presencia de IdU.

Figura 2: Comparaci.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3% Paraformaldehído (PFA)	Fisher Científico	NC0179595	10 g de sacarosa + 100 mL 10X PBS + agua para hacer volumen a 925 mL. Agregue 75 mL de PFA sin metanol al 40%, mezcle y haga alícuotas de 50 mL antes del almacenamiento Almacenamiento: Almacenar a -20 °C
5-yodo-2'-desoxiuridina (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 g/mol. Para caldo de 10 mM: disolver 3,541 mg de IdU en 1 mL de amoníaco líquido 1 N
Anticuerpo anti-BrdU	BD Biociencias	347580	Almacenamiento: Almacenar a 4 °C
Anticuerpo secundario Alexa Fluor Plus 488 anti-ratón	Termo Científico	A32766	Sensible a la luz: mantener en la oscuridad
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Se realiza añadiendo masa específica al volumen de PBS Almacenamiento: Almacenar a 4 °C
Cubierta de vidrio circular	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72230-01
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Medios de crecimiento: RPMI suplementado con L-glutamina, 0,01 mg/mL de insulina bovina; suero fetal bovino a una concentración final del 20% y 1X Pen Strep Almacenamiento: Medios de congelación: medios de crecimiento + 5% DMSO y almacenados a -80 °C
Solución de poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Almacenamiento: Almacenar a 4 °C
Montaje antidecoloración ProLong Diamond con DAPI	Termo Científico	P36962	Almacenamiento: Almacenar a 4 °C
Tripsina-EDTA, 0,25%	Genesee Científico	25-510	Almacenamiento: Almacenar a 4 °C
Agua filtrada estérilmente	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Almacenamiento: Almacenar a 4 °C