Un método basado en inmunofluorescencia para cuantificar el estrés de replicación en células cancerosas

Abstract

Fuente: Ramakrishnan, N. et al., Cuantificación del estrés de replicación en células de cáncer de ovario mediante inmunofluorescencia de ADN monocatenario.J. Vis. Exp. (2023)

El video demuestra un enfoque basado en inmunofluorescencia para cuantificar el estrés de replicación en células cancerosas. Las células tratadas con hidroxiurea producen ADN monocatenario, detectado a través de inmunofluorescencia. El recuento de focos de fluorescencia verde indica el nivel de estrés de replicación en las células cancerosas.

Protocol

NOTA: La línea celular de cáncer de ovario, OVCAR3, se utilizó en estos pasos, pero este protocolo es ampliamente aplicable a muchas otras líneas celulares, incluidas las derivadas de fuentes no ováricas. En la Figura 1 se muestra un esquema del protocolo.

1. Enchapado de las células

1. Haga cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina.
   1. Agregue cubreobjetos de 12 mm de diámetro esterilizados en autoclave a un tubo cónico de 50 mL con solución de poli-L-lisina, y colóquelos en un balancín durante 15 min.
   2. Aspire la solución en una campana de cultivo de tejidos. Lave los cubreobjetos añadiendo agua estéril y vuelva a colocar el tubo que contiene los cubreobjetos en el balancín durante 5 minutos. Repite este paso de lavado tres veces.
   3. Extienda los cubreobjetos recubiertos en un plato estéril y aspire el agua restante. Deje que los cubreobjetos se sequen en la campana de cultivo de tejidos durante 1 h o hasta que no queden gotas de agua. Una vez seco, selle el plato con parafilm y colóquelo a 4 °C.
2. Coloque un cubreobjetos recubierto de poli-L-lisina en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. El uso de cubreobjetos de polilisina es fundamental para evitar el desprendimiento de las células de los cubreobjetos durante la etapa previa a la extracción.
3. Tripsinizar las células OVCAR3 una vez que alcanzan el 70%-80% de confluencia.
   1. Para tripsinizar una placa de cultivo de 10 cm con un 70%-80% de confluente, aspire el medio de la placa y lave con 5-7 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   2. Aspire el PBS, agregue 1 mL de tripsina al 0,25% y coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 8-10 min, o hasta que las células se despeguen del fondo de la placa.
   3. Recoja las células con 5-10 mL de medio y agréguelas a un tubo cónico.
   4. Cuente las células manualmente con un hemocitómetro utilizando procedimientos estándar.
4. Hacer una dilución de 25.000 células/mL y añadir 1 mL de las células en cubreobjetos de poli-L-lisina colocados en los pocillos de las placas de 24 pocillos. Para cualquier otra línea celular, determine un número tal que las células sean aproximadamente 70%-80% confluentes después de tres duplicaciones de población.
5. Cultive las células en el medio de cultivo en condiciones estándar.

>2. Células pulsantes con IdU

1. Para que las células se propaguen correctamente en los cubreobjetos, basta con duplicar la población. Después de una duplicación de la población, pulse las células con 10 μM de 5-yodo-2'-desoxiuridina (IdU) (consulte la Tabla de materiales sobre cómo reconstituir IdU) para las dos duplicaciones de población subsiguientes.
   nota: Hemos probado diferentes análogos de la timidina, incluyendo bromodeoxiuridina (BrdU), 5-cloro-2'-desoxiuridina (CIdU) e IdU. Entre los tres análogos, IdU ofrece la mejor relación señal-ruido. En la Figura 2 se muestran imágenes comparativas de células pulsadas con los tres análogos diferentes. Recomendamos el uso de dos controles negativos: (i) una muestra pulsada sin IdU y (ii) un control sin anticuerpos primarios. Si es necesario evaluar la formación de ssDNA debido a un tratamiento determinado, recomendamos agregar el fármaco después de la primera ronda de duplicación de IdU.
2. Después de pulsar con IdU durante dos duplicaciones de población, recoja las células para obtener imágenes.
   1. Reemplace el medio con 0.5% PBSTx helado (PBS + 0.5% Triton X-100) sobre hielo durante 5 min. Este paso de pre-extracción ayuda a liberar proteínas citoplasmáticas y no unidas a la cromatina, dejando intactas las proteínas unidas a la cromatina. Ciertas líneas celulares pueden desprenderse fácilmente durante la pre-extracción. En tal escenario, se puede utilizar un tampón CSK al 0,5% (10 mM de tuberías (pH 6,8), 100 mM de cloruro de sodio (NaCl), 300 mM de sacarosa, 3 mM de cloruro de magnesio (MgCl₂), 1 mM de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) y 0,5% de Triton X-100).

3. Fijación

1. Aspirar PBSTx e incubar durante 15 minutos con paraformaldehído (PFA) al 3% (Tabla de Materiales) a temperatura ambiente, seguido de tres a cuatro lavados con 1x PBS. Las celdas fijas se pueden mantener a 4 °C hasta pasos posteriores.
   PRECAUCIÓN: El PFA es altamente tóxico y cancerígeno. Evite el contacto con la piel, los ojos y las membranas mucosas. Realice todos los pasos con PFA en una campana extractora y deseche los materiales correctamente.

>4. Permeabilización y bloqueo

1. Después de la fijación, permeabilice las células con PBSTx al 0,5% en hielo durante 5 min. Use suficiente volumen para cubrir todo el cubreobjetos (generalmente entre 500 μL y 1 mL).
2. Lave las celdas de tres a cuatro veces con 0.2% PBST (1X PBS + 0.2% Tween-20) a temperatura ambiente. Un ml de PBST es suficiente para lavar cada pocillo. Realice los lavados seguidos sin ninguna incubación.
3. Aspirar el PBST y bloquear las muestras utilizando albúmina sérica bovina al 5%, BSA (Table of Materials) hecha en 1x PBS (tampón de bloqueo) durante 30 min a temperatura ambiente.

>5. Inmunotinción con el anticuerpo IdU

1. Para la inmunotinción, prepare una cámara humidificada (toalla de papel húmeda en un Tupper de fondo plano). Cubra la tapa de la placa de 24 pocillos con parafilm, colóquela en la cámara humidificada y coloque los cubreobjetos en la tapa de la placa.
2. Prepare el anticuerpo primario anti-BrdU de ratón (Tabla de materiales) diluyéndolo 1:200 en el tampón de bloqueo del paso 4.2. Anteriormente se ha demostrado que el anticuerpo anti-BrdU detecta IdU.
3. Añadir 60 μL de dilución de anticuerpos IdU en la parte superior de los cubreobjetos. Incubar los cubreobjetos durante 1 h a 37 °C.
   1. Alternativamente, use menos solución de anticuerpos si los cubreobjetos se voltean sobre una gota (20-25 μL) de dilución de anticuerpos 1:200 pipeteada en parafilm. Esto también disminuye la probabilidad de que la solución se seque durante la incubación.
4. Después de 1 h de incubación, aspirar el anticuerpo primario. Regrese los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos y lávelos cuatro veces con 0.2% de PBST.
5. Para el anticuerpo secundario, utilice la misma cámara humidificada descrita en el paso 5.1. Anticuerpo secundario conjugado anti-ratón diluido (Tabla de materiales) en el tampón de bloqueo (1:200). Añadir 60 μL de anticuerpo secundario a los cubreobjetos e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 h. Este anticuerpo secundario es sensible a la luz.
6. Aspirar el anticuerpo secundario. Regrese los cubreobjetos a la placa de 24 pocillos y lávelos cuatro veces con 0.2% de PBST.
7. Etiquete los portaobjetos del microscopio y monte los cubreobjetos en los portaobjetos con un medio de montaje de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Tabla de materiales). Guarde los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 h. Se recomienda la incubación de 24 horas si es necesario curar o endurecer el medio de montaje.
   nota: A continuación, los portaobjetos pueden almacenarse a 4 °C antes de ser visualizados en un microscopio de fluorescencia. En la Figura 3 se muestra una imagen representativa.

Results

Figura 1: Esquema de etiquetado de IdU.Las células se pulsan con IdU para dos duplicaciones de población. Si se necesita algún tratamiento farmacológico, debe administrarse después de que la primera población se duplique en presencia de IdU.

Figura 2: Comparaci...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldehído (PFA)	Fisher Científico	NC0179595	10 g de sacarosa + 100 mL 10X PBS + agua para hacer volumen a 925 mL. Agregue 75 mL de PFA sin metanol al 40%, mezcle y haga alícuotas de 50 mL antes del almacenamiento Almacenamiento: Almacenar a -20 °C
5-yodo-2'-desoxiuridina (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 g/mol. Para caldo de 10 mM: disolver 3,541 mg de IdU en 1 mL de amoníaco líquido 1 N
Anticuerpo anti-BrdU	BD Biociencias	347580	Almacenamiento: Almacenar a 4 °C
Anticuerpo secundario Alexa Fluor Plus 488 anti-ratón	Termo Científico	A32766	Sensible a la luz: mantener en la oscuridad
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Se realiza añadiendo masa específica al volumen de PBS Almacenamiento: Almacenar a 4 °C
Cubierta de vidrio circular	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72230-01
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Medios de crecimiento: RPMI suplementado con L-glutamina, 0,01 mg/mL de insulina bovina; suero fetal bovino a una concentración final del 20% y 1X Pen Strep Almacenamiento: Medios de congelación: medios de crecimiento + 5% DMSO y almacenados a -80 °C
Solución de poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Almacenamiento: Almacenar a 4 °C
Montaje antidecoloración ProLong Diamond con DAPI	Termo Científico	P36962	Almacenamiento: Almacenar a 4 °C
Tripsina-EDTA, 0,25%	Genesee Científico	25-510	Almacenamiento: Almacenar a 4 °C
Agua filtrada estérilmente	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Almacenamiento: Almacenar a 4 °C