$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Acoplamiento covalente de anticuerpos de captura a microesferas MagPlex
Cada anticuerpo de captura se conjuga con un conjunto específico de microesferas magnéticas carboxiladas utilizando un procedimiento de dos pasos como se describe a continuación.
NOTA: También está disponible un kit de acoplamiento que incluye todos los reactivos, tampones y materiales necesarios para el acoplamiento de microesferas (consulte TABLA DE MATERIALES).
- Vuelva a suspender la suspensión de microesferas desacoplada de acuerdo con las instrucciones descritas en la hoja de información del producto proporcionada con sus microesferas.
nota: Las instrucciones de resuspensión dependerán del tamaño y el volumen de los viales de microesferas en stock.
- Transfiera 2,5 x 106 de las microesferas de stock a un tubo de microcentrífuga recomendado (ver TABLA DE MATERIALES).
- Coloque el tubo en un separador magnético y permita que se produzca la separación durante 60 segundos.
- Con el tubo aún colocado en el separador magnético, retire el sobrenadante.
nota: Tenga cuidado de no alterar las microesferas.
- Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las microesferas en 100 μL de dH2O mediante vórtice y sonicación durante 20 segundos.
- Repita los pasos 3 y 4.
- Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las microesferas lavadas 80 μL de fosfato sódico 0,1 M monobásico, pH 6,2 por vórtice y sonicación durante 20 segundos.
- Añadir 10 μL de N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) de 50 mg/mL (diluido en fosfato sódico monobásico 0,1 M, pH 6,2) a las microesferas y mezclar suavemente mediante un vórtice.
- Añadir 10 μL de 50 mg/mL de clorhidrato de 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) (diluido en fosfato sódico monobásico 0,1 M, pH 6,2) a las microesferas y mezclar suavemente mediante un vórtice.
- Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente con una mezcla suave por vórtice a intervalos de 10 minutos.
- Coloque el tubo en un separador magnético y permita que se produzca la separación durante 60 segundos.
- Con el tubo aún colocado en el separador magnético, retire el sobrenadante.
nota: Tenga cuidado de no alterar las microesferas.
- Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las microesferas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 250 μL, pH 7,4 por vórtice y sonicación durante aproximadamente 20 segundos.
- Coloque el tubo en un separador magnético y permita que se produzca la separación durante 60 segundos.
- Con el tubo aún colocado en el separador magnético, retire el sobrenadante.
nota: Tenga cuidado de no alterar las microesferas.
- Repita los pasos 13 a 15 para un total de dos lavados.
- Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las microesferas activadas y lavadas en 100 μL de PBS, pH 7,4 por vórtice y sonicación durante aproximadamente 20 segundos.
- Añadir 12,5 μg de anticuerpo de captura a las microesferas resuspendidas (es decir, 5 μg/1 millón de microesferas).
nota: Se prefieren los anticuerpos monoclonales para la captura, pero también se pueden usar anticuerpos policlonales.
NOTA: 5 μg de proteína por 1 millón de perlas suelen tener un buen rendimiento, pero recomendamos ajustar la cantidad para lograr un rendimiento óptimo del ensayo.
- Lleve el volumen total a 500 μL con PBS, pH 7.4.
- Reacción de acoplamiento de mezcla por un vórtice.
- Incubar durante 2 horas con mezcla por rotación a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Coloque el tubo en un separador magnético y permita que se produzca la separación durante 60 segundos.
- Con el tubo aún colocado en el separador magnético, retire el sobrenadante.
nota: Tenga cuidado de no alterar las microesferas.
- Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las microesferas acopladas en 1 ml de PBS, pH 7,4 que contenga 0,02% de Tween-20, 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA), 0,05% de azida sódica (PBS-TBN) por vórtice y sonicación durante 20 segundos.
- Coloque el tubo en un separador magnético y permita que se produzca la separación durante 60 segundos.
- Con el tubo aún colocado en el separador magnético, retire el sobrenadante.
nota: Tenga cuidado de no alterar las microesferas.
- Repita los pasos 24 a 26 para un total de dos lavados.
- Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las microesferas acopladas en 500 μL de PBS-TBN.
nota: Determine el número de microesferas recuperadas utilizando un contador de células o un hemocitómetro.
- Almacene las microesferas acopladas refrigeradas a 2-8 °C en la oscuridad.
nota: También está disponible un protocolo para confirmar la eficiencia del acoplamiento.
>2. Etiquetado de biotina de anticuerpos de detección
- Los anticuerpos de detección se marcaron con biotina utilizando hexanoato de sulfosuccinimidil-6-(biotinamido) EZ-Link de acuerdo con las instrucciones del fabricante con un exceso molar de 20 veces el reactivo de biotina para lograr 4-6 grupos de biotina por molécula de anticuerpo
nota: Los anticuerpos policlonales se utilizan normalmente para la detección, pero los anticuerpos monoclonales también pueden utilizarse si son específicos para un epítopo diferente al del anticuerpo de captura.
nota: Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos biotinilados disponibles en el mercado para la detección.
>3. Detección de organismos por inmunoensayo sándwich de captura multiplexada
Los conjuntos de microesferas acopladas y los anticuerpos de detección marcados generados en los puntos 1 y 2 anteriores se utilizan en un inmunoensayo sándwich de captura multiplexada para detectar y cuantificar las bacterias presentes en una muestra. En la Figura 1 se muestra una descripción general del flujo de trabajo del ensayo.
- Seleccione los viales de stock de los juegos de perlas MagPlex acoplados a anticuerpos de 2 a 8 ºC de almacenamiento.
- Vórtice y sonicate durante 20 segundos.
- Prepare una mezcla de perlas multiplexadas de trabajo de modo que cada juego de perlas tenga una concentración final de 2500 microesferas por 50 μL para cada pocillo de reacción (50.000 perlas/set/ml) en PBS-TBN.
nota: Utilice una hoja de cálculo para determinar los parámetros de preparación para la mezcla de cuentas de trabajo.
nota: También se pueden incluir perlas de control interno (microesferas de monitor RP1) para monitorear el rendimiento del ensayo y del instrumento.
- Pipetee 50 μL de mezcla de perlas de trabajo en los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos.
- Pipetear 50 μL de patrón o muestra para los pocillos apropiados.
- Pipetear 50 μL de PBS-TBN en cada pocillo de fondo.
- Cubra la placa con un sello de aluminio para proteger las perlas de la luz e incube en un agitador de placas a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación a 800 rpm.
- Coloque la placa en un separador de placas magnéticas durante 1 minuto.
- Manteniendo la placa en el separador de placas magnéticas, retire con cuidado el papel de aluminio e invierta la placa para vaciar los pocillos, luego golpee para secar una capa gruesa de toallas de papel de laboratorio 3-4 veces.
nota: Alternativamente, aspire manualmente los pocillos con una pipeta multicanal o use una lavadora de placas automática.
- Utilice una pipeta multicanal para añadir 200 μL de PBS-TBN a cada pocillo y agite durante 1 minuto en un agitador de placas a 800 rpm.
- Coloque la placa en un separador de placas magnéticas durante 1 minuto.
- Manteniendo la placa en el separador de placas magnéticas, invierta la placa para vaciar los pocillos, luego golpee para secar una capa gruesa de toallas de papel de laboratorio 3-4 veces.
nota: Alternativamente, aspire manualmente los pocillos con una pipeta multicanal o use una lavadora de placas automática.
- Repita los pasos 10 a 12 para un total de dos lavados.
nota: Retire la mayor cantidad posible de tampón antes de continuar con el siguiente paso para evitar una posible dilución de la reacción.
- Utilice una pipeta multicanal para añadir 50 μL de tampón de ensayo a cada pocillo y agite durante 1 minuto en un agitador de placas a 800 rpm.
- Diluir el anticuerpo de detección biotinilado a 4 μg/ml en PBS-TBN.
- Añada 50 μL del anticuerpo de detección diluido a cada pocillo.
- Cubra la placa con un sello de aluminio para proteger las perlas de la luz e incube en un agitador de placas a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación a 800 rpm.
- Coloque la placa en un separador de placas magnéticas durante 1 minuto.
- Manteniendo la placa en el separador de placas magnéticas, invierta la placa para vaciar los pocillos, luego golpee para secar una capa gruesa de toallas de papel de laboratorio 3-4 veces.
nota: Alternativamente, aspire manualmente los pocillos con una pipeta multicanal o use una lavadora de placas automática.
- Lave cada pocillo dos veces siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 10-12.
nota: Retire la mayor cantidad posible de tampón antes de continuar con el siguiente paso para evitar una posible dilución de la reacción.
- Utilice una pipeta multicanal para añadir 50 μL de tampón de ensayo a cada pocillo y agite durante 1 minuto en un agitador de placas a 800 rpm. Estreptavidina, conjugado de R-ficoeritrina (SAPE).
- Diluir el reportero SAPE a 4 μg/mL en tampón de ensayo.
- Añadir 50 μL de SAPE diluido a cada pocillo.
- Cubra la placa con un sello de aluminio para proteger las perlas y el SAPE de la luz e incube en un agitador de placas a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación a 800 rpm.
- Coloque la placa en un separador de placas magnéticas durante 1 minuto.
- Manteniendo la placa en el separador de placas magnéticas, invierta la placa para vaciar los pocillos, luego golpee para secar una capa gruesa de toallas de papel de laboratorio 3-4 veces.
NOTA: Alternativamente, aspire manualmente los pocillos con una pipeta multicanal o use una lavadora de placas automática.
- Lave cada pocillo dos veces siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 10-12.
- Añadir 100 μL de PBS-TBN a cada pocillo y agitar durante 1 minuto en un agitador de placas a 800 rpm.
- Analice 50 μL de cada reacción en el analizador Luminex (de acuerdo con el Manual del usuario del analizador utilizado), recogiendo un mínimo de 50 perlas por juego de perlas para el análisis. A continuación se proporciona una breve descripción del xMAP INTELLIFLEX®.
- Seleccione el menú desplegable en la esquina superior izquierda de la pantalla y navegue hasta Configuración de placas.
- Seleccione Placa de ejecución.
- Seleccione el icono Expulsar para expulsar el portador de placas.
- Cargue la placa en el portaplacas y seleccione el icono Retraer para retraer el portaplacas.
- Seleccione el icono Ejecutar para ejecutar la placa.
