Aislamiento de linfocitos T asesinos naturales invariantes de un modelo de ratón

Resumen

Fuente: Meng, M., et al. Inmunoterapia adoptiva de células iNKT en ratones con artritis reumatoide inducidos por glucosa-6-fosfato isomerasa (G6PI).J. Vis. Exp.(2020)

Este video ilustra un método para aislar células T asesinas naturales invariantes, también conocidas como células iNKT. El procedimiento comienza con la inyección de un glicolípido sintético en un ratón para estimular la activación y proliferación de las células iNKT en el bazo. Posteriormente, se preparan suspensiones unicelulares a partir del bazo y se incuban con complejos de reconocimiento de células iNKT marcados con fluoróforos, seguidos de una separación basada en perlas magnéticas, para aislar las células iNKT.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Obtención de linfocitos T citolíticos naturales invariantes (linfocitos iNKT) con terapia celular adoptiva

1. Inducción direccional de células iNKT
   1. Inyectar a ratones normales por vía intraperitoneal α-galactosilceramida (α-GalCer) (0,1 mg/kg de peso corporal).
2. Aislamiento de células iNKT
   1. Tres días después del modelado, inyecte a los ratones por vía intraperitoneal pentobarbital sódica al 1% (50 mg/kg de peso corporal) para anestesia. Los ratones adecuadamente anestesiados no muestran una respuesta de retirada de la pata trasera a un pellizco en el dedo del pie.
   2. Aislar el bazo de un ratón DBA/1 después de inyectarlo intraperitonealmente con α-GalCer. Prepare una suspensión de una sola celda cortando y moliendo el bazo en un tamiz de malla 200.
   3. Lave la suspensión celular con solución salina tamponada con fosfato (PBS), centrifuga a 200 x g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante. Repetir.
   4. Vuelva a suspender las células con 1 ml de sangre entera y solución de dilución de tejidos. Añadir 3 mL de medio de separación de linfocitos de ratón y, a continuación, centrifugar las células durante 20 min a 300 x g a temperatura ambiente.
   5. Recoja la capa de linfocitos de color blanco lechoso (es decir, la segunda capa desde la parte superior), lávela 2 veces con PBS y cuente con un contador de células automatizado.
3. Estrategia de selección positiva de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) para la purificación de células iNKT
   nota: Para el pretratamiento de los tetrámeros CD1d, se diluyó 1 mg/mL de α-Galcer a 200 μg/mL con 0,5% de Tween-20 y 0,9% de NaCl, y se añadieron 5 μL de la solución resultante a 100 μL de la solución de tetrámero CD1d. La mezcla se incubó durante 12 h a temperatura ambiente y se colocó a 4 °C para su uso. El receptor de células T (TCR) β se diluyó 80 veces con agua desionizada. Todos los demás anticuerpos se utilizaron como solución madre.
   1. Vuelva a suspender 10⁷ células con 100 μL de PBS a 4 °C, agregue 10 μL de tetrámero-ficoeritrina CD1d cargado con α-GalCer (CD1d Tetramer-PE) e incube a 4 °C durante 15 min en la oscuridad.
   2. Lave las células 2 veces con PBS y vuelva a suspenderlas en 80 μL de PBS.
   3. Añadir 20 μL de MicroBeads anti-PE e incubarlas a 4 °C durante 20 min en la oscuridad.
   4. Lávelas 2 veces con PBS y vuelva a suspender las células con 500 μL de PBS.
   5. Coloque la columna de clasificación en el campo magnético del clasificador MACS y enjuague con 500 μL de PBS.
   6. Agregue la suspensión de celdas del paso 1.3.4 a la columna de clasificación, recoja el flujo y enjuague 3 veces con tampón PBS.
   7. Elimine el campo magnético y recoja las celdas de la columna de clasificación. En este punto, añade 1 ml de tampón PBS a la columna de clasificación y empuja rápidamente el émbolo a una presión constante para conducir las células marcadas al tubo de recogida y obtener células iNKT purificadas. Cuenta con un contador de celdas automatizado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microperlas anti-PE	Miltenyi	130-048-801	Alemania
Columnas	Miltenyi	Sra.	Alemania
Centrífuga criogénica	Beckman	Allegra® X-15R	América
Ratón CD1d Tetrámero-PE	MBL (en inglés	TS-MCD-1	Japón
Percoll de ratón	Solarbio	P8620	China
Microscopio óptico	Olimpo	Olimpo-II	Japón

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