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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Obtención de linfocitos T citolíticos naturales invariantes (linfocitos iNKT) con terapia celular adoptiva
- Inducción direccional de células iNKT
- Inyectar a ratones normales por vía intraperitoneal α-galactosilceramida (α-GalCer) (0,1 mg/kg de peso corporal).
- Aislamiento de células iNKT
- Tres días después del modelado, inyecte a los ratones por vía intraperitoneal pentobarbital sódica al 1% (50 mg/kg de peso corporal) para anestesia. Los ratones adecuadamente anestesiados no muestran una respuesta de retirada de la pata trasera a un pellizco en el dedo del pie.
- Aislar el bazo de un ratón DBA/1 después de inyectarlo intraperitonealmente con α-GalCer. Prepare una suspensión de una sola celda cortando y moliendo el bazo en un tamiz de malla 200.
- Lave la suspensión celular con solución salina tamponada con fosfato (PBS), centrifuga a 200 x g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante. Repetir.
- Vuelva a suspender las células con 1 ml de sangre entera y solución de dilución de tejidos. Añadir 3 mL de medio de separación de linfocitos de ratón y, a continuación, centrifugar las células durante 20 min a 300 x g a temperatura ambiente.
- Recoja la capa de linfocitos de color blanco lechoso (es decir, la segunda capa desde la parte superior), lávela 2 veces con PBS y cuente con un contador de células automatizado.
- Estrategia de selección positiva de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) para la purificación de células iNKT
nota: Para el pretratamiento de los tetrámeros CD1d, se diluyó 1 mg/mL de α-Galcer a 200 μg/mL con 0,5% de Tween-20 y 0,9% de NaCl, y se añadieron 5 μL de la solución resultante a 100 μL de la solución de tetrámero CD1d. La mezcla se incubó durante 12 h a temperatura ambiente y se colocó a 4 °C para su uso. El receptor de células T (TCR) β se diluyó 80 veces con agua desionizada. Todos los demás anticuerpos se utilizaron como solución madre.
- Vuelva a suspender 107 células con 100 μL de PBS a 4 °C, agregue 10 μL de tetrámero-ficoeritrina CD1d cargado con α-GalCer (CD1d Tetramer-PE) e incube a 4 °C durante 15 min en la oscuridad.
- Lave las células 2 veces con PBS y vuelva a suspenderlas en 80 μL de PBS.
- Añadir 20 μL de MicroBeads anti-PE e incubarlas a 4 °C durante 20 min en la oscuridad.
- Lávelas 2 veces con PBS y vuelva a suspender las células con 500 μL de PBS.
- Coloque la columna de clasificación en el campo magnético del clasificador MACS y enjuague con 500 μL de PBS.
- Agregue la suspensión de celdas del paso 1.3.4 a la columna de clasificación, recoja el flujo y enjuague 3 veces con tampón PBS.
- Elimine el campo magnético y recoja las celdas de la columna de clasificación. En este punto, añade 1 ml de tampón PBS a la columna de clasificación y empuja rápidamente el émbolo a una presión constante para conducir las células marcadas al tubo de recogida y obtener células iNKT purificadas. Cuenta con un contador de celdas automatizado.