Mejora de la transducción viral en células asesinas naturales utilizando un polímero catiónico

Resumen

Fuente: Nanbakhsh, A., et al. El dextrano mejora la eficiencia de la transducción lentiviral de las células NK primarias murinas y humanas. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra un ensayo para la transducción viral mediada por polímeros catiónicos en células asesinas naturales (NK). Las células se incuban con vectores lentivirus transgénicos que codifican una proteína fluorescente. La adición de un polímero catiónico permite que el virus se adhiera a las células e integre su ARN en el genoma del huésped, expresando la proteína fluorescente. La fluorescencia se cuantifica para evaluar la mejora de la transducción inducida por polímeros.

Protocolo

1. Transducción de células NK primarias murinas y humanas con lentivirus

1. Suspender células NK primarias de ratón o humanos en una placa de 24 pocillos a 0,5 × 10⁵/mL de medio en presencia de sobrenadante de lentivirus de proteína verde fluorescente (GFP) a 5, 10 y 20 multiplicidad de infección (MOI) y en presencia de Pb (8 μg/mL), PS (8 μg/mL) o dextrano (8 μg/mL).
2. Centrifugar las placas a 1.000 × g durante 60 min.
3. Sin decantar el sobrenadante, cultivar las células durante la noche (16-18 h) en una incubadora a 37 °C infundida con 5,2% de CO₂.
4. Lavar con 10 mL de PBS y volver a suspender en 2 mL de medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 completo en presencia de interleucina 2 (IL-2, 300 U/mL).
5. Recoja las células NK transducidas el día 7 golpeando suavemente los frascos.
   1. Active las células recolectadas con concentraciones tituladas de mAb del grupo asesino natural antinatural unido a placas 2D (NKG2D) (A10) mediante el recubrimiento de placas de poliestireno altamente absorbentes de proteínas de 96 pocillos con concentraciones de 2,5 μg/mL de mAb anti-NKG2D durante la noche.
   2. Lave cada pocillo con 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces antes de la adición de células NK primarias.
6. Recoja los sobrenadantes de cultivo utilizando una pipeta multicanal entre 16 y 18 h después de la activación para cuantificar citocinas como el interferón-gamma (IFN-γ). Genere curvas estándar utilizando las citocinas recombinantes proporcionadas con los kits de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
7. Pruebe la viabilidad de las células NK mediante la tinción con anexina-V/7-amino-actinomicina D (7-AAD) y determine el porcentaje de células necróticas entre las células NK transformadas mediante un citómetro de flujo.
   1. Para realizar este ensayo, recoja las células NK murinas y humanas cuatro días después de la transducción, lávese dos veces con 10 ml de PBS frío a 500 × g durante 5 minutos cada una e incube con un kit de anexina-V (PE)/7-AAD.
8. Utilice un software de citometría de flujo adecuado para analizar los datos. Seleccione la población de células vivas y analice la expresión de GFP (canal de isotiocianato de fluoresceína [FITC]) como medida de la transducción viral.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
dextrano	Sigma-Aldrich	90-64-91-9
Polibreno (Pb)	Sigma-Aldrich	TR-1003
Sulfato de protamina (PS)	Sigma-Aldrich	pág. 3369
RPMI1640	Corning	10-040-CV
Interferón gamma (IFN-γ )	eBiociencia	14-7311-85
Solución de tinción de loduro de propidio	Bd	51-66211E
Lipofectamina 3000	Termo Fisher	L3000015
Isoflurano	fénix	NDC 57319-559-05
Células 293T	ATCC	CRL-3216
Matraces T75	Corning	430641U
Kits ELISA	Ebiociencia	00-4201-56