Transfección de macrófagos primarios con ARNm modificado

Resumen

Fuente: Herb, M. et al., Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in vitro. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra el proceso de transfección de macrófagos primarios con ARNm modificado que codifica proteína fluorescente verde. Estos ARNm modificados, diseñados para reducir la inmunogenicidad y mejorar su estabilidad, aseguran el éxito de la transfección y posterior expresión de proteínas verdes fluorescentes, que se confirma mediante microscopía de fluorescencia.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

NOTA: Realice todos los pasos con guantes. Realice todos los pasos de transfección bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación de las células. Antes de trabajar con ARNm, limpie todos los instrumentos, como las pipetas, y todas las superficies con etanol al 70% y/o un tensioactivo que degrade la ARNasa (Tabla de materiales). Asegúrese de que todos los tubos de reacción estén libres de ARNasa y sean estériles. Use solo agua estéril sin ARNasa para las diluciones. Utilice exclusivamente puntas de pipeta con filtros. Cambie las puntas de pipeta después de cada paso de pipeteo.

>1. Generación de la plantilla de ADN

NOTA: La plantilla de ADN para la transcripción de ARNm in vitro utilizando este protocolo debe contener una secuencia promotora T7 para permitir el acoplamiento de la ARN polimerasa. Si el plásmido que contiene la secuencia de ADN de la proteína de interés ya contiene una secuencia promotora T7 correctamente orientada directamente aguas arriba de la secuencia de interés, es necesario realizar la linealización del plásmido (ver paso 1.1.). De lo contrario, conecte un promotor T7 a la secuencia de interés mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, consulte el paso 1.2.).

1. Linealización de plásmidos que contienen promotores T7
   1. Linealizar plásmidos que ya contienen una secuencia promotora T7 correctamente orientada por digestión con una enzima de restricción que corta aguas abajo del codón de parada de la secuencia de interés. De lo contrario, la transcripción no terminará correctamente después de la secuencia de interés.
      NOTA: Es mejor usar enzimas de restricción dejando extremos romos o salientes de 5 pies.
   2. Confirmar la linealización completa del plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa del ADN plasmídico no digerido frente al digerido.
   3. Purifique el ADN plasmídico linealizado antes de usarlo como plantilla de ADN para la transcripción de ARNm in vitro utilizando un kit de purificación de ADN (Tabla de materiales).
2. Fijación del promotor T7 por PCR
   1. Utilice un cebador directo que contenga los siguientes componentes (en el orden indicado de 5' a 3'): alrededor de 5 pb aleatorios aguas arriba del promotor (por ejemplo, GAAAT); la secuencia del promotor T7 (TAATACGACTCACTATAG); dos G adicionales para aumentar la eficiencia de la transcripción (GG); la parte específica de la secuencia objetivo que es homóloga a la secuencia de plásmido que rodea el codón de inicio.
      nota: Debe estar compuesto por 3-6 pb aguas arriba de la secuencia KOZAK y el codón de inicio, la secuencia KOZAK y el codón de inicio (generalmente GCCACC ATG G), 12-18 pb aguas abajo del codón de inicio. Si la secuencia de interés aún no contiene una secuencia KOZAK o un codón de inicio, estos se pueden adjuntar en este paso simplemente incluyéndolos en la secuencia del cebador.
   2. Calcule la t_m del cebador directo solo teniendo en cuenta la parte homóloga a la secuencia objetivo.
   3. Para evaluar la formación de dímeros/horquillas, utilice toda la secuencia de cebadores, que puede superar fácilmente los 50 pb.
   4. Utilice un cebador inverso ubicado en algún lugar aguas abajo del codón de parada.
      NOTA: Si la secuencia de interés aún no contiene un codón de parada, se puede adjuntar en este paso simplemente incluyéndolo en la secuencia del cebador.
   5. Utilice los cebadores directos e inversos para realizar una PCR utilizando una polimerasa de alta fidelidad con corrección (Tabla de materiales).
   6. Confirme la generación de un solo producto y tamaño de amplicón mediante electroforesis en gel de agarosa (por ejemplo, use un gel de agarosa al 1% y corriente constante de 100 V).
   7. Purifique el producto de PCR antes de usarlo como plantilla de ácido desoxirribonucleico (ADN) para la transcripción in vitro de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) utilizando un kit de purificación de ADN.

>2. Generación de ARNm

1. Descongele todos los componentes del kit de transcripción de ARNm in vitro (consulte la Tabla de materiales). Vórtice durante 5 s y gire hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g. Mantener en hielo hasta su uso.
2. Prepare la mezcla de reacción para la transcripción in vitro de ARNm en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL en el siguiente orden (volumen total de 40 μL): 20 μL de mezcla de 10 análogos de tapón anti-reverso/trifosfato de nucleósidos (ARCA/NTP) (incluida en el kit de transcripción de ARNm in vitro); 0,25 μL de trifosfato de 5-metil-citidina (5-mCTP) (la concentración final (f.c.) es de 1,25 mM; 50% del CTP total); 0,25 μL de trifosfato de pseudouridina (pseudo-UTP) (f.c. es 1,25 milímetro; 50% del total de la PCD); X μL de molde de ADN; 2 μL de mezcla de ARN polimerasa T7 (incluida en el kit de transcripción de ARNm in vitro); Y μL de H₂O. libre de ARNasa
   NOTA: X es un volumen que contiene al menos 1 μg de ADN. Por ejemplo, 1,6 μL de una solución madre de 625 ng/μL. Y es el volumen de reserva para el volumen total de 40 μL.
3. Vórtice durante 5 s y gire hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g. Incubar a 37 °C durante 30 min a 400 rpm en un mezclador térmico para la transcripción in vitro.
4. A continuación, añada 2 μL de DNasa I directamente en la mezcla de reacción para eliminar el ADN moltest. Vórtice durante 5 s y gire hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
5. Incubar a 37 °C durante 15 min a 400 rpm en un mezclador térmico. Tome una alícuota de 2 μL para el gel de control (paso 3.3) y guárdelo a -80 °C.
6. Para el relamparo de poli(A), agregue los siguientes componentes directamente a la mezcla de reacción anterior (hasta un volumen final de 50 μL): 5 μL de tampón de reacción de poli(A) polimerasa 10x y 5 μL de poli(A) polimerasa (ambos incluidos en el kit de transcripción de ARNm in vitro). Vórtice durante 5 s y gire hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
7. Incubar la mezcla a 37 °C durante 30 min a 400 rpm en una termobatidora. Tome una alícuota de 2 μL para el gel de control (paso 3.3) y guárdelo a -80 °C.
8. Para la desfosforilación de los extremos 5' del ARNm, agregue los siguientes componentes directamente a la mezcla de reacción anterior (hasta un volumen final de 60 μL): 3 μL de H_2Olibre de ARNasa; 6 μL de tampón de reacción de fosfatasa antártica 10x; 3 μL de fosfatasa antártica (15 unidades para un volumen de reacción de 60 μL). Vórtice durante 5 s y gire hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
9. Incubar la mezcla a 37 °C durante 30 min a 400 rpm en un mezclador térmico.
10. Inactivación térmica de la fosfatasa antártica por incubación a 80 °C durante 2 min.
    nota: Lo ideal es utilizar un mezclador térmico separado, no espere hasta que el primer mezclador alcance la temperatura deseada.

>3. Purificación de ARNm

1. Purifique el ARNm transcrito in vitro utilizando un kit de purificación de ARN específico (Tabla de materiales).
   1. Añada X μL de solución de elución a la mezcla de reacción de ARNm del paso 2.10. Mezclar invirtiendo 5 veces. Añadir 300 μL de concentrado de solución aglutinante. Mezclar pipeteando suavemente 5 veces.
      NOTA: X es el volumen de reserva para un volumen total de 100 μL. Por ejemplo, agregue 40 μL de solución de elución a 60 μL de mezcla de reacción de ARNm.
   2. Añadir 100 μL de etanol libre de ARNasa. Mezclar pipeteando suavemente 5 veces.
   3. Coloque una columna de filtro en uno de los tubos de recolección suministrados. Transfiera la mezcla de reacción de ARNm suavemente al centro del filtro sin tocar el filtro. Centrifugar a 15.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente (RT).
   4. Levante con cuidado la columna del filtro y deseche el flujo en el tubo de recolección. Vuelva a colocar la columna del filtro en el mismo tubo de recolección.
   5. Agregue 500 μL de solución de lavado (no olvide agregar 20 mL de etanol sin ARNasa antes de usar la solución de lavado por primera vez).
   6. Centrifugar a 15.000 x g durante 1 min en RT. Repita los pasos 3.1.4-3.1.6 para lavar una vez más.
   7. Centrifugar a máxima velocidad (17.900 x g) durante 1 min a RT para eliminar cualquier líquido residual de la columna de filtro. Tome con cuidado la columna de filtro del tubo de recolección. Coloque la columna de filtro en un nuevo tubo de recolección.
   8. Agregue 50 μL de tampón de elución en el centro del filtro sin tocar el filtro. Incubar a 65 °C durante 10 min en un mezclador térmico.
   9. Centrifugar a 15.000 x g durante 1 min a RT. Retire la columna de filtro y deséchela.
2. Mida la concentración y la pureza del ARNm eluido, por ejemplo, utilizando un espectrofotómetro de microvolumen para medir la absorbancia a 260 y 280 nm.
   NOTA: Una relación A260/A280 de 1,8-2,1 es indicativa de ARNm altamente purificado.
3. Verifique la presencia de un solo producto, la longitud correcta de la transcripción y la cola de poli(A) analizando las alícuotas de los pasos 2.5 y 2.7 mediante electroforesis en gel de agarosa en condiciones de desnaturalización (por ejemplo, use un gel de agarosa al 1,2% que contenga 20 mM de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico [MOPS], 5 mM de acetato de sodio, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 20% de formaldehído y ejecute en 20 mM MOPS, 5 mM de acetato de sodio, 1 mM de EDTA y 0,74 % de formaldehído a 100 V de corriente constante).
4. Almacene el ARNm purificado en el tubo de elución a -80 °C hasta la transfección. Si se utilizan solo cantidades bajas de ARNm para la transfección, alicuone el ARNm para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
   NOTA: el ARNm puede almacenarse a -80 °C durante aproximadamente 1 año.

>4. Preparación de macrófagos

1. Eutanasia de ratones C57/BL6 (use ratones del mismo sexo y de 6 a 24 semanas de edad) por luxación cervical.
   NOTA: Los mismos ratones se pueden utilizar para el aislamiento de macrófagos primarios (PM) (paso 4.2) y la generación de BMDM (pasos 4.3 y 4.4). Para el aislamiento de PM use al menos dos ratones. Si solo se va a generar BMDM, un ratón suele ser suficiente.
2. Enriquecimiento inmunomagnético de macrófagos peritoneales.
   1. Llene una jeringa de 10 ml con una cánula de 0,9 x 40 mm con 8 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada y 2 ml de aire. Enjuague la cavidad peritoneal con PBS. El aire formará una burbuja que minimiza las fugas del PBS.
   2. Recoja rápidamente el lavado peritoneal con la misma jeringa y transfiéralo a un tubo de centrifugación cónico de 50 mL. Combine las células peritoneales de varios ratones si es necesario. Mantenga la suspensión celular en hielo.
   3. Centrifugar la suspensión celular a 650 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 5 mL de NaCl al 0,2 % durante 30 s para lisar los glóbulos rojos.
   4. Añadir 5 mL de NaCl al 1,6% a un volumen total de 10 mL para reconstituir las condiciones isotónicas. Centrifugar a 650 x g durante 5 min a 4 °C.
   5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 97,5 μL de tampón de clasificación magnética de células (MCS) (2 mM de ácido etilendiaminotetraacético [EDTA], 0,5% de albúmina sérica bovina [BSA] en PBS) por 1 lavado peritoneal (p. ej., si se enjuagó a tres ratones, resuspender en 292,5 μL).
   6. Añadir 2,5 μL de perlas paramagnéticas conjugadas a un anticuerpo específico CD11b por cada 97,5 μL de suspensión celular (p. ej., añadir 7,5 μL a 292,5 μL).
   7. Incubar en hielo durante 15 minutos a 150 rpm en un agitador orbital.
   8. Centrifugar la suspensión de la célula a 650 x g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de la célula en 1 mL de tampón MCS.
   9. Agregue 4 mL de tampón MCS a un volumen total de 5 mL y lave las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces.
   10. Repita los pasos 4.2.8 y 4.2.9 dos veces más para un total de tres pasos de lavado.
   11. Durante los pasos de lavado, coloque una columna LS en un separador de celdas magnéticas (consulte la tabla de materiales). Enjuague la columna con 3 mL de tampón MCS.
       nota: Evite las burbujas, ya que pueden obstruir la columna.
   12. Vuelva a suspender el pellet de celda en 1 mL de tampón MCS. Agregue 3 mL de tampón MCS a un volumen total de 4 mL, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres veces.
   13. Transfiera los 4 mL de suspensión celular a la columna LS enjuagada.
       NOTA: Nuevamente, evite las burbujas, ya que pueden obstruir la columna.
   14. Espere hasta que el depósito de la columna esté completamente vacío. No agregue líquido adicional hasta que la columna deje de gotear.
   15. Agregue 3 mL de tampón MCS a la columna. Luego, espere hasta que el depósito de la columna esté completamente vacío. Repita el paso 4.2.15 dos veces más.
   16. Coloque la columna LS en un tubo de centrifugación cónico de 15 mL. Aplique 5 mL de tampón MCS en la columna. Espere hasta que 2 mL de líquido hayan pasado a través de la columna, luego use el émbolo para empujar suavemente la fracción restante dentro del tubo.
   17. Centrifugar la suspensión de la célula a 650 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
   18. Vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor (DMEM+FCS).
   19. Determine el número de células viables contando en una solución de azul de tripán en una cámara de recuento Neubauer y las células de semilla en DMEM+FCS en placas de cultivo.
       NOTA: Siembre PM a una densidad de 100,000 células/pocillo en una placa de microtitulación de fondo plano. No utilice placas tratadas con cultivo de tejidos, ya que las PM no se pueden separar de ellas. En su lugar, use placas no tratadas.
3. Generación de BMDM
   1. Retire la piel y los músculos de las patas traseras con unas tijeras. Lave cada pierna por inmersión corta en etanol al 70%.
   2. Separe las piernas y abra ambos extremos del fémur y la tibia cortando con unas tijeras.
   3. Llene una jeringa de 5 mL llena con una cánula de 0,6 mm x 30 mm con 5 mL de RPMI 1640 de endotoxina muy baja (VLE) y enjuague la médula ósea de los huesos abiertos en una placa de cultivo.
   4. Combine la médula ósea de varios ratones si es necesario repitiendo los pasos 4.3.1-4.3.3. Transfiera la médula ósea a un tubo de centrifugación cónico de 50 mL.
   5. Centrifugar la suspensión de médula ósea a 650 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
   6. Vuelva a suspender el pellet de células en 5 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (cloruro de amonio al 8,3%, NH₄Cl, 0,1 M Tris) e incube durante 5 min a RT para lisar los glóbulos rojos.
   7. Centrifugar la suspensión celular a 650 x g a 4° C durante 5 min y desechar el sobrenadante.
   8. Resuspenda el pellet celular en 1 mL de medio VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de HEPES, 1% de piruvato de sodio y 10 ng/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos recombinantes (M-CSF) (RPMI+++++).
   9. Agregue 4 mL de RPMI+++++ a un volumen total de 5 mL.
   10. Prepare 5 placas de Petri sin tratar de 92 mm x 16 mm con levas (ver Tabla de Materiales) por ratón pipeteando 7 mL de medio RPMI+++++ en cada placa.
   11. Transfiera 1 mL de solución celular a las 5 placas de cultivo preparadas e incube a 37 °C y 5% de CO₂.
   12. Después de 4 días, alimente las células agregando 4 mL de RPMI+++++. Después de 6-7 días, las células de la médula ósea se diferencian completamente en BMDM.
4. Cosecha de BMDM
   1. Retire completamente el medio de las placas de cultivo. Agregue 5 mL de EDTA 0.2 mM tibio en PBS a cada plato.
   2. Raspe suavemente toda la placa con un raspador de celdas para separar el BMDM. Combine las suspensiones celulares en un tubo de centrifugación cónico de 50 mL.
   3. Vuelve a tirar de la cadena los 5 platos. Use el mismo volumen de 5 mL de EDTA caliente de 0.2 mM en PBS para los 5 platos. Combina esta suspensión de celdas con la del paso anterior.
   4. Centrifugar la suspensión celular a 650 x g durante 5 min a 4° C y desechar el sobrenadante.
   5. Vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de medio VLE RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS, 1% de HEPES, 1% de piruvato de sodio y 10 ng/mL de M-CSF recombinante, pero sin antibióticos (RPMI^++++).
   6. Determine el número de células viables contando en solución de azul de tripano en una cámara de recuento de Neubauer y células de semilla en RPMI⁺⁺⁺⁺ en placas de cultivo.
      nota: Siembre BMDM a una densidad máxima de 50.000 células/pocillo en una placa de microtitulación de fondo plano. No utilice placas tratadas con cultivo de tejidos, ya que la BMDM difícilmente se puede separar de estas. En su lugar, use placas no tratadas.

>5. Transfección de macrófagos con ARNm

1. Calcule el volumen requerido de tampón de transfección de ARNm.
   nota: El volumen de tampón de transfección de ARNm requerido depende del tamaño del pocillo: use 200 μL para la transfección en una placa de 6 pocillos, 100 μL en una placa de 12 pocillos, y así sucesivamente. Agregue siempre un poco de volumen de repuesto debido a la pérdida de pipeteo (pero no demasiado, para evitar la dilución indebida del ARNm). Por ejemplo, use 450 μL en lugar de 4 x 100 μL = 400 μL para transfectar en 4 pocillos de una placa de 12 pocillos.
2. Calcule el volumen requerido de reactivo de transfección de ARNm. El reactivo de transfección de ARNm se añade en una proporción de 1:50. Por ejemplo, se requieren 9 μL de reactivo de transfección de ARNm para un volumen final de 450 μL.
3. Calcule la cantidad total de ARNm necesaria. Se requieren al menos 100 ng por cada 100.000 macrófagos para una transfección eficiente, 200 ng funcionan aún mejor (por ejemplo, 800 ng de ARNm para transfectar 400.000 macrófagos).
   1. Multiplique la cantidad calculada de ARNm requerida por el número total de pocillos que deben transfectarse (por ejemplo, 4 pocillos con 400.000 macrófagos cada uno: se requieren 4 x 800 ng = 3.200 ng de ARNm en total para todos los pocillos). Por ejemplo, si su stock de ARNm es de 426,8 ng/μL, se necesitan 7,49 μL para la transfección óptima de 4 pocillos con 400.000 macrófagos cada uno.
4. Agregue el volumen calculado del tampón de transfección de ARNm (paso 5.1.) menos los volúmenes del reactivo de transfección de ARNm (paso 5.2) y el ARNm (paso 5.3) a un tubo de reacción. Por ejemplo, 450 μL - 9 μL - 7,49 μL = 433,51 μL.
5. Descongele el stock de ARNm y mézclelo volteando suavemente el tubo de elución. Agregue el volumen calculado de ARNm (paso 5.3) al tubo de reacción con tampón de reacción de ARNm (en el ejemplo presentado anteriormente: 7,49 μL en 433,51 μL).
6. Vórtice durante 5 s y gire hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
7. Agite el reactivo de transfección de ARNm durante 5 s y gire hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
8. Agregue el volumen calculado del reactivo de transfección de ARNm (paso 5.2) al tubo de reacción que contiene el tampón de transfección de ARNm y el ARNm (en el ejemplo presentado anteriormente: 9 μL de reactivo de transfección de ARNm).
9. Agite la mezcla de transfección durante 5 s y gire hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
10. Incubar durante 15 min en RT.
11. Mientras tanto, reemplace el medio de cultivo de los macrófagos por un medio de cultivo fresco y tibio (consulte los pasos 4.2.18. y 4.4.5).
12. Después de la etapa de incubación 5.10, agregue la mezcla de transfección a los pocillos que contienen los macrófagos en un volumen apropiado para el tamaño del pocillo (ver paso 5.1). Agregue la mezcla de transfección gota a gota en un círculo desde el exterior hasta el centro del pozo.
13. Balancee suavemente la placa, primero en dirección vertical y luego en dirección horizontal para asegurar una distribución uniforme de la mezcla de transfección en el pozo. A continuación, incubar a 37 °C y 5 % de_CO2. La síntesis de la proteína codificada por el ARNm transfectado comenzará poco después de la transfección. Para obtener los mejores resultados, incube durante al menos 6 h.
14. Después de la incubación, analice la eficiencia de la transfección mediante microscopía de (inmuno)fluorescencia, citometría de flujo o inmunotransferencia, o utilice los macrófagos transfectados para el experimento de elección.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-metil-CTP (100 mM)	Biosiencia de Jena	NU-1138S	almacenado a -20 °C
Fosfatasa antártica	BioLabs de Nueva Inglaterra	M0289	almacenado a -20 °C
Tampón de reacción de fosfatasa antártica (10X)	BioLabs de Nueva Inglaterra	B0289	almacenado a -20 °C
anticuerpo anti-NEMO/IKKγ	Invitrogen	MA1-41046	almacenado a -20 °C
Anticuerpo anti-β-actina	Sigma-Aldrich	A2228	almacenado a -20 °C
Placas de Petri de 92,16 mm con levas	Sarstedt	8 millones 21 mil 473	almacenado en RT
CD11b Microbeads ratón y humano	Miltenyi Biotec	130-049-601	almacenado a 4 °C
Cre recombinasa + T7-Promotor imprimación directa	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3', almacenado a -20 °C
Cre recombinasa + T7-Promotor cebador inverso	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, almacenado a -20 °C
Kit de purificación de ADN: Kit de purificación QIAquick PCR	Qiagen	28104	almacenado en RT
Imprimación eGFP + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5'-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3', almacenado a -20 °C
Imprimación inversa eGFP + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5'-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3', almacenado a -20 °C
Búfer de digestión rápida (10X)	Termo Científico	B64	almacenado a -20 °C
FastDigest XbaI	Termo Científico	FD0684	almacenado a -20 °C
Polimerasa de alta fidelidad con corrección: Q5 ADN-polimerasa de alta fidelidad	Nueva Inglaterra Biolabs Inc	M0491S	almacenado a -20 °C
Imprimación directa IKKβ + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, almacenado a -20 °C
Imprimación inversa IKKβ + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, almacenado a -20 °C
kit de transcripción de ARNm in vitro: Kit de ARNm HiScribe T7 ARCA (con cola de poliA)	BioLabs de Nueva Inglaterra	E2060	almacenado a -20 °C
Columnas LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	almacenado en RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	almacenado en RT
Tampón y reactivo de transfección de ARNm: jetMESSENGER	Transfección Polyplus	409-0001DE	almacenado a 4 °C
Plásmido mutante IKKβ IKK-2S177/181E	Addgene	11105	almacenado a -20 °C
Plásmido mutante NEMOC54/347A	Addgene	27268	almacenado a -20 °C
plásmido pEGFP-N3	Addgene	62043	almacenado a -20 °C
Poli (I: C)	Calbiochem	528906	almacenado a -20 °C
plásmido pPGK-Cre			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Nuevas variantes de la recombinasa Cre inducible: un nuevo mutante de la proteína de fusión Cre-PR exhibe una sensibilidad mejorada y un rango ampliado de inducibilidad. Ácidos nucleicos Res. 29, 47e (2001). almacenado a -20 °C
Pseudo-UTP (100 mM)	Biosiencia de Jena	NU-1139S	almacenado a -20 °C
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976	almacenado en RT
Anticuerpo CD11b anti-ratón para ratas, conjugado con APC	BioLeyenda	101212	almacenado a 4 °C
Anticuerpo F4/80 anti-ratón conjugado con PE	eBiociencia	12-4801-82	almacenado a 4 °C
M-CSF recombinante	Peprotech	315-02	almacenado a -20 °C
Kit de purificación de ARN: Kit de limpieza de transcripción MEGAclear	ThermoFisher Scientific	AM1908	almacenado a 4 °C
Tensioactivo degradador de ARNasa: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	almacenado en RT
LPS ultrapuro de E.coli O111:B4	Invivogen		almacenado a -20 °C
Plásmido IKKβ de tipo salvaje	Addgene	11103	almacenado a -20 °C
Plásmido NEMO de tipo salvaje	Addgene	27268	almacenado a -20 °C