NOTA: El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para eliminar células específicas utilizando fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT). Los controles y otros detalles sobre NIR-PIT y la viabilidad de las células se pueden encontrar en otros lugares.
>1. Conjugación de Infrarrojo 700 (IR700) a anticuerpos monoclonales (mAb)
- Prepare el mAb de interés a 2-5 mg/ml en una solución de hidrogenofosfato disódico (Na2, HPO4) (pH 8,6) de 0,1 M.
- Mezclar 6,8 nmol de mAb con 30,8 nmol de 10 mM de IR700 en una solución de 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6) en un tubo de microcentrífuga e incubar a RT durante 1 hora, cubierto con papel de aluminio.
- Lave la columna PD-10 (ver Tabla de Materiales/Equipo) con 15 ml de PBS, dos veces. Cargue la muestra del paso 1.2.
- Purifique la mezcla a través de la columna PD-10 por elución de PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Aquí, la elución estaba a lo largo del color de la banda de IR700. Para una muestra de 300 μl, la fracción de elución de PBS suele estar entre 2,5 ml y 4,4 ml.
- Determine la concentración de proteínas con tinción de Coomassie midiendo la absorción a 595 nm con un espectrofotómetro. Determine la concentración de IR700 con absorción a 689 nm para confirmar el número de moléculas de fluoróforo conjugadas con cada molécula de mAb.
NOTA: Es importante determinar un número óptimo de conjugación de moléculas IR700 en 1 mAb con un espectrofotómetro. En general, alrededor de 3 moléculas IR700 en 1 molécula de mAb es óptimo tanto para el trabajo in vitro como para el in vivo. Los métodos de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE) se pueden utilizar para confirmar si el mAb y el IR700 están unidos o no.
- Almacenar a 4 °C después de determinar la concentración de proteína.
>2. Preparación de Cultivos Celulares 3D Mixtos (Esferoide Mixto)
- Aplique agua estéril (alrededor de 1 ml) en la sección del depósito de placas de las placas colgantes.
- Prepare varias proporciones de los tipos de células de interés: células de proteína fluorescente A431-luciferasa-verde (A431-luc-GFP) y células de proteína fluorescente roja 3T3 (3T3-RFP), con cada muestra conteniendo 5.000 células en total, suspendidas en 50 μl de medio de cultivo.
NOTA: Prepare proporciones 1:100, 10:100, 25:100, 50:100, etc. de tipos de células de interés en los medios de cultivo según el tipo de célula.
- Incubar la mezcla durante 5-7 días en la placa colgante de 96 pocillos en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de dióxido de carbono. Cambie el medio de cultivo cada 2 días. NOTA: Para hacer el esferoide 3D con precisión, manipule la placa con cuidado, ya que las gotas que contienen células se caen fácilmente antes de formar formas 3D.
- Observe la morfología y el tamaño de los esferoides utilizando un microscopio de campo claro invertido con un aumento de 10X a 40X. NOTA: Aunque depende de los tipos de células y del tamaño de la gota colgante, asegúrese de que el diámetro del esferoide sea de alrededor de 400-600 μm después de 7 días de incubación en la placa colgante de 96 pocillos.
>3. NIR-PIT in vitro para cultivo celular mixto en 3D
- Cambie el medio de las placas colgantes a un medio que contenga 10 μg/ml de conjugado anticuerpo-fotoabsorbente (APC) e incube durante 6 horas en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de dióxido de carbono.
- Después de 6 horas de incubación, lave el esferoide dos veces con medios de cultivo frescos (sin rojo de fenol). Transfiera suavemente el esferoide a una placa de 50 mm con fondo de vidrio con 100 μl de medio de cultivo libre de rojo de fenol fresco utilizando una punta de pipeta estéril de 200 μl con la punta cortada. Coloque un esferoide en cada plato.
- Observe el esferoide con un microscopio de campo claro invertido para detectar el cambio de morfología. Para observar los reporteros ópticos (por ejemplo, GFP y RFP) utilice un microscopio de fluorescencia con los siguientes ajustes de filtro: GFP — filtro de excitación de 469 nm y filtro de emisión de 525 nm; RFP: filtro de excitación de 559 nm y filtro de emisión de 630 nm.
- Coloque el diodo emisor de luz (LED) sobre el plato con fondo de vidrio para la irradiación.
NOTA: Los esferoides pueden exponerse a la luz NIR en el microscopio o en la campana laminar.
- Mida la densidad de potencia de la luz NIR con un medidor de potencia óptica. De acuerdo con esta medición, irradia luz NIR a través de diodos emisores de luz (LED) que emiten luz a longitudes de onda de 670 a 710 nm a 2 J/cm2.
NOTA: La luz LED puede penetrar una profundidad máxima de aproximadamente 5 pulgadas. Los efectos citotóxicos de NIR-PIT dependen únicamente de la energía dada, independientemente de la potencia, la densidad y la duración de la exposición.
- Después de la irradiación, transfiera el esferoide a una nueva placa colgante con 50 μl de medios de cultivo frescos e incube durante 1 día en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de dióxido de carbono.
- Transfiera suavemente el esferoide a una placa con fondo de vidrio con 100 μl de medio de cultivo fresco (sin rojo de fenol) utilizando una punta de pipeta estéril de 200 μl con la punta cortada. Observe el esferoide con un microscopio de fluorescencia 1 día después de NIR-PIT utilizando los ajustes de filtro descritos en el paso 3.3.
- Detecte las células muertas mediante la adición de yoduro de propidio al medio a una concentración final de 2 μg/ml, o mediante la pérdida de fluorescencia citoplasmática de GFP utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 1B).
- Repita los pasos 3.1 a 3.6 si las células objetivo no se han eliminado por completo.
