Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto. Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Generación de ratones HIS
- Cría de ratones BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS)
nota: Esta cepa es extremadamente inmunodeficiente, sin células T, B o asesinas naturales (NK). Por lo tanto, se deben utilizar medidas rigurosas para prevenir infecciones oportunistas. Mantener la colonia en una dieta que contenga trimetoprima y sulfadiazina en un horario alterno de 2 semanas con una dieta normal. Mantenga en el nivel más alto posible de precaución un espacio de alojamiento (p. ej., una ducha de barrera con acceso limitado).
- Mantener colonias de ratones homocigotos BALB/c -Rag2null, Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) y BALB/c Rag2null Il2RγCnull SirpaBalb/c (BRG) como reproductores.
- Criar BRGSN/N×BRGB/B para generar crías de BRGSB/N, para ser utilizadas como receptoras de células madre humanas. En esta colonia, los BRGSB/N son más saludables que los BRGSN/N, y se injertan a niveles equivalentes (más que los BRG).
- Aislamiento de células madre humanas CD34+ de sangre de cordón umbilical (CB)
nota: No se utilizan antibióticos para este procedimiento. Por lo tanto, es imprescindible una buena técnica estéril.
- Coloque una gradilla de tubos cónicos de 50 mL, así como 3 tubos cónicos de 15 mL y ~10x 50 mL en una cabina de bioseguridad (BSC) esterilizada. Rocíe una bolsa de recolección de sangre con etanol al 70% y déjela secar en el BSC.
- Calcule el número de tubos cónicos de 50 mL necesarios para el aislamiento del gradiente de densidad CB = volumen CB/15, redondeado hacia arriba y a un número de tubo par. Calcular el volumen sanguíneo por tubo = volumen CB/número de tubos. Vierta la sangre con cuidado de la bolsa CB en cada tubo cónico; esto es un máximo de 15 mL por tubo. Utilice una pipeta automática y una pipeta serológica de 25 ml para mezclar la sangre 1:1 con PBS estéril pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Utilice una pipeta automática a baja velocidad y una pipeta serológica de 10 mL para recubrir lentamente la sangre con una solución de gradiente de densidad de 1,077 g/mL a temperatura ambiente (RT) (consulte la Tabla de materiales) sin alterar la interfaz. Evite que la punta de la pipeta toque el fondo del tubo. Repita para todos los tubos. A continuación, centrifugar durante 30 min a 850 x g, sin frenado, a RT para garantizar el mantenimiento del gradiente de densidad.
- Visualice la capa de leucocitismo celular en la parte superior del gradiente de densidad de 1,077 g/mL como una capa blanca turbia. Retire y deseche la capa de plasma hasta unos 10 ml por encima de la capa leucitaria con una pipeta serológica de 25 ml y una pipeta automática.
- Recoja el pelaje leucocitario con una pipeta de transferencia estéril o serológica. Use la pipeta como una espátula para raspar las células del costado del tubo cónico mientras suelta el bulbo (o pipetea lentamente) para extraer las células. Combine las capas leucocitarias de dos tubos cónicos de 50 mL en un nuevo tubo cónico de 50 mL.
- Lave las células vertiendo 45 ml de solución salina equilibrada estéril de Hanks (HBSS) que contenga un 2% de suero fetal bovino (FBS) en cada tubo cónico. Centrífuga durante 11 min a 360 x g en RT.
- Aspire los medios de lavado hasta el pellet en todos los tubos. Utilice una pipeta serológica de 10 mL y una pipeta automática para resuspender el primer pellet en 10 mL de HBSS que contenga un 2% de FBS. Vuelva a suspender cada gránulo en los mismos 10 ml de HBSS y enjuague cada tubo con 10 ml adicionales de HBSS para recoger todas las células en un solo tubo.
- Vierta 45 mL de HBSS estéril que contenga un 2% de FBS en el tubo cónico. Centrifugar durante 10 min a 360 x g, a 4 °C.
- Aspire el tampón de lavado hasta el pellet de celda y vuelva a suspender el pellet en 20 mL de tampón separador de celdas magnético (consulte la Tabla de materiales). Retire una pequeña alícuota para contar las células con un hemacitómetro a una dilución de 1:20 en azul de metileno. Suma el número de celdas azules y blancas. Centrífuga a 360 x g, durante 10 min a 4 °C.
nota: Este protocolo utiliza la tecnología de perlas magnéticas (ver Tabla de Materiales). El protocolo puede modificarse para su uso con cualquier tecnología de separación celular, con suficiente pureza y rendimiento de las células madre CD34+.
- Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células CD34+ aislado de la sangre del cordón umbilical en 300 μL de tampón separador de células magnético por 1 x 108 células. Agregue primero 100 μL de reactivo de bloqueo del receptor Fc (FcR) y luego 100 μL de perlas magnéticas CD34+ por 1 x 108 celdas. Incubar a 4 °C durante 30 min (sin hielo).
- Añadir 5 mL de tampón separador de células magnético por 1 x 108 células y centrifugar a 360 x g durante 10 min a 4 °C. Repita el paso de lavado y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de tampón separador de células magnético por 1 x 108 células en un tubo cónico de 15 mL etiquetado como "no fraccionado".
- Etiquete otros dos tubos cónicos de 15 ml "CD34-" y "CD34+". Coloque los tres tubos cónicos de 15 mL (no fraccionados, CD34- y CD34+) en las ranuras A1, B1 y C1, respectivamente, en una rejilla de enfriamiento (consulte la Tabla de materiales). Separe las celdas utilizando el programa de selección positiva de dos columnas en un separador automático de celdas magnéticas (consulte la Tabla de materiales) en un BSC, de acuerdo con las instrucciones del instrumento del fabricante.
- Expansión y congelación de células madre humanas CD34+
- Alícuota 10 μL de la suspensión celular CD34+ recuperada (2 mL) en un portaobjetos de hemocitómetro y cuente las células con un aumento de 10x. Calcule el número total de células CD34+ multiplicando el recuento de células por 2 x 104. Divida el número total de células CD34+ por 250.000 para calcular el número de viales que se van a congelar (50.000 células por cría de ratón antes de la expansión in vitro).
- Prepare el suero de ternera fetal (FCS) al 10% de CB medium Iscove (más 1 mL adicional para la pérdida de filtrado), suplementado con 40 ng/mL de factor de células madre, 20 ng/mL de ligando de tirosina quinasa similar a FMS (Flt3L) y 10 ng/mL de interleucina-6 (IL-6), y páselo a través de un filtro de 0,22 μm. Vuelva a suspender las células CD34+ a 100.000 por ml de medio CB e incube a 37 °C. En el día 3, agregue un volumen equivalente de medio CB sin citocinas al matraz que contiene las células y el medio CB con citocinas.
nota: La adición de estas citocinas al medio CB promueve la supervivencia y la expansión de las células CD34+, al tiempo que evita la diferenciación.
- Coseche las células CD34+ expandidas el día 5. Pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo y recogerla en un tubo cónico de 50 mL. Agregue suficiente medio CB para cubrir el fondo del matraz. Con un raspador de celdas, raspe todo el fondo del matraz. Recoja todos los medios en el mismo tubo de 50 ml y centrifugue a 360 x g durante 11 minutos.
- Resuspender las células en 2 mL de medio CB. Guarde la última gota de la pipeta en una placa de 96 pocillos para contar. Diluya las células 1:1 en azul tripán y añada 10 μL al hematitómetro, luego cuente y promedie las células de cuatro cuadrantes. Calcule el número total de células CD34+ multiplicando el recuento de células por 4 x 104 y registre la viabilidad.
- Hacer n+1 mL de medio de congelación, donde n es el número de viales de congelación calculado en el paso 1.3.1. Prepare el medio de congelación agregando 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO) al FBS y manténgalo en hielo. Etiquete los crioviales con CB#, CD34+ d5 y fecha.
- Centrifugar las células CD34+ a 360 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el medio hasta el pellet y volver a suspender el pellet en el medio de congelación. Alícuota 1 mL de suspensión celular a cada vial y divida el resto en partes iguales entre los viales. Agregue los viales a un congelador de celda de isopropanol refrigerado a 4 °C, colóquelos a -80 °C y transfiéralos a nitrógeno líquido para almacenar durante >90 días.
- Irradiación de crías de ratón
- Recoja las crías de BRGSB/N, de 1 a 3 días después del nacimiento, en una caja de plástico esterilizada en autoclave con acolchado. Agregue una pequeña cantidad de ropa de cama con los cachorros. Etiqueta la caja con el número de jaula y el número de cachorros.
- Configure el irradiador (consulte la Tabla de materiales) para una dosis de 300 rad. Coloque la caja de cachorros en el irradiador y expóngalos a 300 rad. Lleve a los cachorros a su jaula, colóquelos en una pila y cúbralos con ropa de cama.
- Inyecciones de cachorros y preparación de células CD34+
- Comience la preparación de las células CD34+ ~3 h después de la irradiación. Caliente 10 mL de medio CB en un tubo cónico de 50 mL. Realice todos los pasos en un BSC estéril.
- Recupere un vial de células CD34+ expandidas y congeladas in vitro por cada cuatro a seis cachorros para inyectar. Descongele rápidamente a 55 °C, hasta que solo se vea una pequeña cantidad de hielo, y agregue las células al medio CB calentado (el vial aún debe estar frío al tacto). Utilice 1 mL de medio para enjuagar cada vial y centrifugar las células a 360 x g durante 12 min a 4 °C.
NOTA: Se encontró que la descongelación rápida a 55 °C produce una mejor viabilidad celular (90%-95%) que la descongelación a 37 °C.
- Aspire el medio con cuidado. Vuelva a suspender el pellet (pequeño) en 2 mL de medio CB, mezcle suavemente y agregue ~ 30 μL de la suspensión celular a un solo pocillo en una placa de conteo. Diluya 1:1 en azul de tripán, luego agregue 10 μL a un hemocitómetro y cuente y promedie las células a partir de cuatro cuadrantes.
- Calcule el número total de células CD34+ multiplicando el recuento de células por 4 x 104 y luego registre la viabilidad. Centrifugar a 360 x g durante 12 min a 4 °C.
- Aspire el medio con cuidado y vuelva a suspender el pellet de células en 100 μL de PBS estéril por n+1 crías para inyectar, lo que da como resultado 250.000-450.000 células CD34+ por ratón. Coloque el tubo cónico en hielo en un contenedor de transporte y viaje al vivero para la inyección de cachorros.
- Lleve una lámpara de calor, pañales, jeringa de 1 mL, aguja de 18 G, aguja de 30 G y la preparación de células CD34+ en recipientes estériles al vivero BSC. Coloque un pañal estéril ~ 2 pies debajo de la lámpara de calor. Recupere la jaula con la camada que se va a inyectar y colóquela en el BSC.
- Ensamble la jeringa con una aguja biselada de 18 G. Haciendo coincidir el ángulo del tubo cónico con el bisel de la aguja, mezcle suavemente y extraiga la suspensión celular. Coloque los cachorros en el pañal para que se calienten (esté atento al sobrecalentamiento). Retire el aire de la jeringa y reemplace la aguja de 18 G con la aguja de 30 G, y luego empuje con cuidado la jeringa hasta que la suspensión de la celda esté justo en la punta >nota: Alternativamente, se puede usar una jeringa de insulina.
- Lleve un cachorro a la vez al borde del pañal, lejos de la lámpara de calor. Inmovilice al cachorro de costado debajo del pulgar y el índice, lo que permite una vista clara de la cara. Fíjate en la vena que atraviesa la mejilla debajo de donde estará la oreja. Inserte la aguja de manera superficial en la vena (IV) más cercana al ojo e inyecte lentamente 50 μL de células.
- Compruebe si se está formando una burbuja a partir de una inyección subcutánea. Si es así, inserte la aguja más profundamente y proceda a inyectar las células. Una pequeña gota de sangre/hematoma será visible cuando tenga éxito.
- Con la cría aún inmovilizada, realizar una inyección intrahepática (IH) con otros 50 μL de células (100 μL en total por cría de IV+IH). El hígado se puede visualizar como una mancha oscura entre la banda blanca de leche y la caja torácica. Coloque el cachorro inyectado en un pañal más alejado de los cachorros no inyectados y caliente.
nota: La inyección intravenosa produce un mejor quimerismo a largo plazo que la inyección IH sola, pero las inyecciones intravenosas no siempre son exitosas. Por lo tanto, dividir la inyección entre IV e IH asegura el injerto en un mayor porcentaje de ratones.
- Repita las inyecciones de venas faciales e IH para todos los cachorros. Limpie la sangre, devuelva a los cachorros al nido en su jaula y cúbralos con ropa de cama.
