Terapia adyuvante en un modelo de ratón con un tumor subcutáneo resecado de forma incompleta

Resumen

Fuente: Rwandamuriye, F. X. et al., Un modelo de ratón de sarcoma de tejido blando resecado incompletamente para probar terapias (neo)adyuvantes.J. Vis. Exp.(2020)

Este video ilustra las pruebas de terapia adyuvante o adicional en un modelo de ratón con tumores subcutáneos resecados incompletamente. El ratón parcialmente resecado del tumor se trata con un anticuerpo dirigido a la proteína anticitotóxica de las células T reguladoras, lo que podría reducir el recrecimiento del tumor y sugerir una terapia adyuvante eficaz.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Inoculación de células

1. Preparación de células y animales
   1. Asegúrese de que la línea celular se mantenga en los medios recomendados. Por ejemplo, mantener la línea celular WEHI 164 en el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 2 mM de L-glutamina, 10% de suero fetal bovino, 20 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetinasulfónico (HEPES), 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
      nota: Pase las células al menos 3 y hasta 5 veces después de ser retiradas del almacenamiento criogénico. Para garantizar una viabilidad celular óptima, las células deben dividirse cuando tengan entre un 70 y un 80% de confluentez. Las líneas celulares tumorales deben analizarse para detectar micoplasma, ya que la infección puede alterar el crecimiento celular e influir en la respuesta inmunitaria in vivo.
   2. Un día antes de la inoculación, afeitar los ratones en el flanco inferior derecho con tijeras.
      nota: En este experimento se utilizaron ratones hembra BALB/c, de entre 8 y 12 semanas de edad, de peso normal (16 a 22 gramos).
   3. El día de la inoculación, se cosechan las células WEHI 164 cuando el 70-80% confluyen por tripsinización.
      1. Aspire el medio de cultivo de los matraces de cultivo de tejidos y, a continuación, añada una solución tamponada de fosfato estéril (1x PBS), para eliminar los restos de suero fetal bovino (FBS).
      2. Aspirar el PBS de los matraces de cultivo de tejidos. Añadir 3 mL de tripsina al 0,05% (para un matraz T75) y luego agitar el matraz de modo que toda la superficie del matraz con células quede cubierta por tripsina.
      3. Incubar el matraz a 37 °C, 5% de CO₂ incubadora durante 3 min. Revise las células periódicamente, golpeando los lados del matraz para ver si las células se han desprendido.
      4. Retire los matraces de la incubadora de cultivos celulares y agregue 5 mL de medio suplementado con FBS para neutralizar la tripsina.
         nota: No deje las células en tripsina más tiempo del necesario, ya que esto puede dañar las células y provocar una baja viabilidad celular.
      5. Suspensión de pipetas varias veces para obtener una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga cónico.
      6. Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.
   4. Lave las celdas tres veces en 1x PBS.
      1. Vuelva a suspender las células en 50 ml de PBS estéril 1x y lave las células pipeteando la suspensión de la célula hacia arriba y hacia abajo. Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.
      2. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 15 mL de PBS estéril 1x. Lave las células pipeteando la suspensión de la célula hacia arriba y hacia abajo. Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.
      3. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en exactamente 10 mL de PBS estéril 1x. Lave las células como en el paso 1.1.4.2 y transfiera una pequeña cantidad (aproximadamente 100 μL) de suspensión celular a un tubo de centrífuga para su recuento. Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.
   5. Determine el número de células utilizando el método de exclusión de azul de tripán mediante el uso de un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Resuspenda las células en 1x PBS estéril a una concentración de 5 x 10⁶ células/mL. Mantenga la suspensión celular en hielo.
      nota: La viabilidad de las células tumorales debe ser igual o superior al 80 % para garantizar un crecimiento tumoral reproducible.
2. Inoculación subcutánea
   1. Mezcle bien la suspensión celular y llene una jeringa con una aguja de 26 G con 100 μL de suspensión celular (5 x 10⁵ celdas) en 1x PBS estéril. Repita la mezcla de células antes de cargar la siguiente jeringa.
      nota: Mantenga las células en hielo durante todo el procedimiento para mantener la viabilidad.
   2. Sujete el ratón adecuadamente, asegurando el acceso al flanco inferior derecho. Inocular al ratón por vía subcutánea en el flanco inferior derecho afeitado.
      nota: Asegúrese de que la inoculación no esté en el peritoneo levantando ligeramente la aguja, que debe ser visible debajo de la piel. Se debe formar un bulto en forma de burbuja debajo de la piel después de la inoculación.
   3. Monitorizar los ratones según lo requerido por la aprobación ética aplicable y realizar la resección quirúrgica cuando los tumores hayan crecido hasta un tamaño de unos 50^mm2.

>2. Resección quirúrgica parcial del tumor

NOTA: Este protocolo requiere DOS investigadores; uno para procedimientos quirúrgicos (SURGEON) y otro para el monitoreo de ratones (ASSISTANT).

1. Configuración de la cirugía
   1. En el día 12 después de la inoculación, cuando los tumores hayan alcanzado un tamaño de aproximadamente 50^mm2, dosifique a los ratones 100 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina s.c. en el pescuezo, 30 minutos antes de la cirugía.
   2. Configure el área quirúrgica con una almohadilla térmica cubierta con una bata de banco y coloque un cono nasal para la anestesia. Esterilice las herramientas quirúrgicas antes de usarlas y entre cada animal usando un esterilizador de perlas calientes, permitiendo que las herramientas se enfríen antes de usarlas. Tenga el siguiente equipo quirúrgico limpio y al alcance de la mano: clorhexidina, hisopo, gasa, gel para los ojos, dos pinzas curvas, tijeras, aplicador de clip, removedor de clip y recambios de clip (Figura 1A, 1B).
   3. Caliente la cámara de calentamiento a 37 °C y coloque otra almohadilla térmica para la recuperación (Figura 1C). Coloque las herramientas esterilizadas sobre una superficie estéril, como almohadillas esterilizadas en autoclave.
2. anestesia
   1. Coloque el ratón en la cámara de inducción y anestesie al ratón con isoflurano al 4% (4% en oxígeno al 100% a un caudal de 1 L/min) hasta que la frecuencia respiratoria disminuya a aproximadamente 60 respiraciones por minuto (1 por segundo) (esto suele tardar <1 min)
      nota: No dejes al ratón en la cámara durante mucho tiempo, ya que eso puede provocar asfixia y la muerte. Solo tenga un ratón bajo anestesia a la vez.
   2. Transfiera el ratón a la almohadilla térmica de la mesa de cirugía, coloque el ratón con la nariz en el cono de la nariz y mantenga el estado anestésico con isoflurano al 3-4% en oxígeno al 100% a un caudal de 0,5 L/min. Controle la frecuencia respiratoria para asegurarse de que se mantenga la profundidad de la anestesia.
      nota: El ASISTENTE debe monitorear la respiración del ratón durante toda la cirugía para asegurarse de que se mantenga el nivel correcto de anestesia. Disminuya la concentración de anestésico si la respiración se vuelve demasiado lenta o aumente la concentración si la profundidad de la anestesia es demasiado superficial. Si el ratón comienza a jadear, retírelo del cono de la nariz, disminuya la concentración de anestésico y espere hasta que la respiración se normalice antes de volver a colocarlo en el cono de la nariz.
   3. Realice una "prueba de pellizco" y una "prueba de reflejo corneal" para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado antes de comenzar la cirugía.
      nota: El movimiento de cualquier parte del ratón es una indicación de que el ratón no está completamente anestesiado. El animal debe recibir inmediatamente anestésico adicional aumentando la concentración de anestésico.
   4. Cubre los ojos del ratón con una pequeña cantidad de gel oftálmico para evitar la sequedad ocular.
3. Procedimiento quirúrgico
   1. Frote el área quirúrgica 3 veces con clorhexidina alcohólica. Con unas pinzas y unas tijeras, haga una incisión recta de 1 cm a lo largo de la cara dorsal, a 3 mm del tumor (Figura 2A, 2B)
      nota: La estandarización de la incisión a 1 cm en cada ratón (utilizando una regla) permite una evaluación uniforme de la cicatrización de la herida entre ratones. La localización de la incisión a 3 mm del tumor permite una terapia adyuvante intratumoral posterior sin fugas de la herida.
   2. Con unas pinzas, retire la facia y el tejido graso subcutáneo entre el tumor y el peritoneo. Normalmente, el tumor subcutáneo se adhiere al lado de la piel.
   3. Abra la herida sujetando suavemente la piel del lado portador del tumor con pinzas e "invierta" el tumor para que sea visible por fuera (Figura 2C, 2D).
      nota: La sección del tumor que se va a citorreductar debe estar más cerca de la abertura para tener suficiente piel para cerrar la herida. Tenga cuidado de no cortar la piel al extirpar el tumor.
   4. Con unas tijeras, corte la cápsula tumoral por la mitad para extraerla, comenzando desde la base del tumor más cercana a la abertura.
   5. Para una cirugía con un 50% de reducción de potencia, corte a través de la mitad del tumor. Con pinzas curvas, recoja la sección del tumor que se va a extirpar (50%); Recoja los restos del área citorreducta.
   6. Para una citorreducción del 75%, realice una citorreducción del tumor del 50% como se indica en la parte 2.3.5 anterior. A continuación, corte por la mitad el 50% restante del tumor y recoja el 25% del tumor con pinzas curvas como se ha descrito anteriormente.
4. Cierre del sitio quirúrgico
   1. Vuelva a colocar el tumor restante debajo de la piel y, con fórceps, junte los colgajos de piel y alinee la piel a lo largo de la herida.
   2. Mantenga la piel unida a 5 mm del borde de la herida y use clips quirúrgicos para cerrar la herida, comenzando por el lado más cercano a las pinzas. Aplique tantas pinzas como sea necesario para asegurarse de que no quede expuesto ningún tejido subyacente. Generalmente, se aplican de tres a cuatro clips con espacios de 2 mm entre clips.
      nota: Si algún clip no está bien aplicado, retírelo con un removedor de clips y reemplácelo con clips nuevos.
5. Recuperación de ratones
   1. Permita que los ratones se recuperen colocándolos en la cámara de calentamiento caliente (37 ° C).
   2. Coloque la jaula del ratón en la almohadilla térmica. Monitoree a los ratones en la cámara de calentamiento hasta que se hayan recuperado de la anestesia (despiertos y caminando) y luego vuelva a colocar a los ratones en la jaula. Deje la jaula en la almohadilla térmica durante 10 minutos más, hasta que los ratones se hayan vuelto más activos.
   3. Dale a los ratones comida húmeda y blanda. Monitoree a los ratones 1 hora después de la cirugía para su recuperación y asegúrese de que las pinzas permanezcan en su lugar. Asegúrese de que la jaula esté mitad encendida y mitad fuera de la almohadilla térmica para permitir que los animales autorregulen la temperatura mientras están desatendidos.
   4. Dosificar a ratones con 0,1 mg/kg de buprenorfina (100 μL por vía subcutánea en el pescuezo) 6-8 horas después de la cirugía (al final del día). Monitorizar a los ratones a primera hora de la mañana siguiente y dosificarlos de nuevo con 0,1 mg/kg de buprenorfina (100 μL por vía subcutánea en el pescuezo). Dele más comida húmeda según sea necesario.
   5. Monitoree a los ratones diariamente durante los próximos siete días. Los clips se pueden eliminar después de siete días con el removedor de clips.
6. Tratamiento adyuvante o neoadyuvante
   1. Tratar a los ratones perioperatoriamente con terapia (neo)adyuvante en un momento dado, dependiendo del tratamiento de interés.
   2. Por ejemplo, trate a los ratones con una dosis de 100 μg de anti-CTLA-4 por vía intraperitoneal (i.p.) el día 15 después de la inoculación o con tres dosis de 200 μg de anti-PD-1 i.p. los días 15, 17 y 19 después de la inoculación.

Resultados

Figura 1: Imágenes representativas de la configuración de la cirugía.(A) Una imagen completa de la configuración de la cirugía que muestre las herramientas quirúrgicas (enumeradas en el paso 2.1) y la máquina anestésica. (B) Una imagen instantánea de la mesa quirúrgica que muestre todos los materiales al alcance de la mano. (C) Una cámara de calentam...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de insulina de 0,5 mL de calibre 26	Becton Dickinson, Australia	326769	ninguno
2-Mercaptoetanol	Life Technologies Australia Pty Ltd	21985023	ninguno
Máquina de gas anestésico	Darvall Vet, Australia	Referencia: 2848	ninguno
Anti-CTLA-4	BioXcell, Estados Unidos	BE0164	ninguno
Anti-PD-1	BioXcell, Estados Unidos	BP0273	ninguno
Inyección de clorhidrato de buprenorfina, 0,3 mg/ml	RB healthcare UK Limited, Reino Unido	55175	Orden de prescripción
Exfoliante quirúrgico con clorhexidina 4%	Perigo Australia, Australia	CHL01449F(fregar	ninguno
Suero fetal bovino	CellSera, Australia	AU-FBS-PG	ninguno
Pinza Fina 10,5 cm	Casa de cirugía, Australia Occidental	CC74110	ninguno
Pinza Fina 12 cm Dentada	Casa de cirugía, Australia Occidental	CC74212	ninguno
Pinza Halsted 14 cm	Casa de cirugía, Australia Occidental	CD01114	ninguno
Cámara de calentamiento	Datesand Ltd, Reino Unido	Mini-Thermacage	ninguno
HECTÁREAS (1M)	Life Technologies Australia Pty Ltd	15630080	ninguno
Isoflurano	Henry Schein Salud Animal, Australia	Referencia: 29405	Orden de prescripción
Ungüento lubricante para los ojos	Alcon	N/A	ninguno
Penicilina/estreptomicina 1000X	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140122	ninguno
Solución tamponada de fosfato 10x	Life Technologies Australia Pty Ltd	70013-032	ninguno
Clips Reflex de 7 mm	Científico capaz, Australia	AS59038	ninguno
Aplicador de clip para heridas Reflex de 7 mm	Científico capaz, Australia	AS59036	ninguno
Removedor de pinzas para heridas Reflex	Científico capaz, Australia	AS59037	ninguno
Circuito respiratorio de anestesia para roedores Qube	Darvall Vet, Australia	#7885	ninguno
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medio + L-glutamina	Life Technologies Australia Pty Ltd	21870092	ninguno
Tijera Iris STR 11 cm	Casa de cirugía, Australia Occidental	KF3211	ninguno
Tijera Iris STR 9 cm	Casa de cirugía, Australia Occidental	JH4209	ninguno
Pequeña cámara de inducción	Darvall Vet, Australia	Referencia: 9630	ninguno
TrypLE express 1x	Life Technologies Australia Pty Ltd	12604-021	ninguno