Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Procesamiento de la muestra de piel humana del donante
NOTA: La muestra de piel humana utilizada en este trasplante fue una muestra grande recogida del abdomen de un paciente sano. La muestra debe tener al menos 15 cm x 7,5 cm. Las limitaciones de tamaño pueden afectar al número de ratones para los que se dispone de piel y a la elección del tamaño del injerto.
- Mantener la muestra de piel a temperaturas frías (en hielo; 4 °C) antes de la preparación y el injerto. Mantenga la muestra húmeda en un recipiente cerrado para la recolección de muestras con la gasa empapada en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: No se recomienda almacenar la muestra de piel a 4 °C durante más de 2 días. Sin embargo, existen informes en los que las muestras de piel se almacenan durante más tiempo.
cautela: Trate todo el tejido humano con las precauciones estándar de riesgo biológico.
- Prepare el dermatoma de la muestra de piel humana en una campana de cultivo de tejidos con presión negativa esterilizada sobre una tabla de disección esterilizada.
- Coloque la muestra de piel, con la epidermis hacia arriba, en la tabla de disección. Limpie la epidermis con una almohadilla estéril con alcohol y luego con PBS.
- Fije el borde más cercano de la piel en su lugar con un alfiler en T de disección de 1.5 pulgadas (consulte la Tabla de materiales).
- Dermatice la muestra de piel con un grosor de 400 μm, aplicando una presión constante mientras corta hacia adelante en un ángulo de 30°-45°. Siga todas las instrucciones y medidas de seguridad específicas del instrumento (consulte la Tabla de Materiales).
NOTA: Para obtener más información sobre la técnica del dermatoma, consulte un informe publicado anteriormente.
- Prepare una placa de Petri de 100 mm x 20 mm colocando una gasa estéril empapada en PBS estéril en el fondo de la placa. Coloque la piel, con la epidermis hacia arriba, sobre la gasa húmeda.
- Selle y cubra los bordes de la placa con una película de sellado semitransparente (consulte la Tabla de materiales) para garantizar que la muestra no esté contaminada. Almacene la muestra a 4° C antes del injerto.
>2. Acondicionamiento y preparación preoperatoria
- Prepare los instrumentos estériles y una estación quirúrgica estéril para el injerto. Utilice toallas de papel esterilizadas en autoclave como superficies estériles para la colocación de instrumentos y ratones.
NOTA: Los ratones pueden ser injertados después del destete, pero preferiblemente se injertan entre las 8 y 10 semanas de edad. Se pueden injertar ratones de ambos sexos.
- Realizar la preparación quirúrgica, como la depilación, en un área físicamente separada de la estación quirúrgica.
- Prepare el anti-GR1 (ver Tabla de Materiales) diluyéndolo a 1 mg/mL en solución salina estéril. Dosificar a cada ratón con 100 μg/100 μL de la solución anti-GR1 por vía intraperitoneal después de la inducción de la anestesia.
- Anestesiar a los ratones, uno a la vez, con isoflurano u otros anestésicos aprobados institucionalmente.
NOTA: El isoflurano debe administrarse a una concentración del 3%-5% durante la inducción. Una vez que el ratón esté inmóvil, reduzca la concentración de isoflurano a 1%-3% para afectar la duración de la cirugía.
- Monitoree el ratón para determinar la profundidad adecuada de la anestesia observando la frecuencia respiratoria, la ausencia de respuesta de pellizco de los dedos de los pies y la coloración rosada adecuada de las orejas y la boca.
cautela: Utilice maquinaria anestésica y métodos de eliminación adecuados, y evite la exposición a los vapores de isoflurano.
- Transfiera el mouse a una almohadilla térmica u otra fuente de calor (consulte la tabla de materiales).
- Administre el ungüento oftálmico frotando una pequeña gota de ungüento en el ojo con un dedo enguantado.
- Administrar analgésicos Buprenorfina (0,08 mg/kg) y Carprofeno (5 mg/kg) (ver Tabla de Materiales) por vía subcutánea pellizcando la piel e inyectando en ángulo paralelo al cuerpo
NOTA: Preparar la analgesia pre-tratamiento siguiendo los protocolos institucionales. Seguir las directrices institucionales para la selección y administración de analgésicos. El método de analgesia utilizado en este estudio se describe en el paso 2.7 y en la Figura 1.
- Administre el anti-GR1 (preparado en el paso 2.4) por vía intraperitoneal levantando ligeramente el ratón por la cola, exponiendo el abdomen e inyectando en un ángulo de 30° con una jeringa de insulina de 1 ml (12,7 mm).
- Use maquinillas eléctricas seguras para animales (consulte la Tabla de materiales) para afeitar las partes media y superior del lado dorsal del ratón.
- Limpie todo el vello y aplique una cantidad generosa de ungüento depilatorio sobre la piel afeitada durante 30 s a 1 min.
- Limpie completamente el ungüento depilatorio con una toalla de papel y PBS.
3. Procedimiento de trasplante
- Transfiera el ratón a una ubicación quirúrgica secundaria, lejos de la estación de depilación.
- Esterilice el sitio quirúrgico con el hisopo de yodo en un movimiento circular, comenzando en el centro y trabajando hacia el borde del área depilada.
- Coloque un pedazo de envoltura de plástico estéril sobre el ratón y corte una ventana en el plástico un poco más grande que el tamaño del área a injertar.
- Corta una porción en forma de rectángulo de 10 mm x 10 mm de piel donante para injertarla con un bisturí. Para ello, sujeta firmemente la piel del donante con la parte posterior de las pinzas y corta a lo largo de las pinzas con el bisturí.
- Con las tijeras quirúrgicas, corte un área rectangular de piel de ratón que coincida con el tamaño de la pieza de piel del donante, creando un lecho de injerto. Use pinzas para separar la piel del cuerpo y corte la piel con las tijeras en ángulo opuesto al cuerpo para evitar cortar profundamente en la facia.
- Coloque la pieza de piel del donante, con la epidermis hacia arriba, sobre el lecho de injerto preparado.
- Con la parte posterior de las pinzas, manipule la piel, deslizándola hacia adelante y hacia atrás hasta que la piel del donante quede completamente plana contra el lecho del injerto.
- Agregue gotas de adhesivo para tejidos de pegamento quirúrgico (consulte la Tabla de materiales) donde la piel del donante se encuentra con la piel del ratón y sostenga la piel del ratón y del donante con pinzas durante 1-2 segundos para que el pegamento se adhiera a los tejidos. Sella completamente el borde del injerto y deja que el pegamento se seque por completo.
- Venda los ratones (Figura 2) siguiendo los pasos a continuación.
- Corte un pedazo de gasa de vaselina (consulte la Tabla de materiales) lo suficientemente grande como para cubrir completamente el área del injerto.
- Cubra el injerto con la gasa de vaselina y presione ligeramente la gasa contra la piel con pinzas.
- Corta una tira de un apósito de película transparente a lo largo para que el ancho sea lo suficientemente grande como para cubrir la herida del ratón.
- Presione firmemente el apósito de película transparente, con el adhesivo hacia abajo, sobre la gasa. Gire rápidamente el mouse para envolver el apósito completamente alrededor del torso, asegurándose de que se ajuste bien sin impedir la respiración, y que todas las extremidades estén libres para el movimiento.
- Coloque el mouse en una jaula de recuperación y vigílelo hasta que esté alerta y se mueva. Proporcione una fuente de calor en una parte de la jaula durante al menos 15 minutos después de la recuperación.
NOTA: Se espera que los animales se recuperen dentro de 1-5 minutos después de colocarlos en la jaula de recuperación.
