Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto. Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Establecimiento de un modelo humano basado en PBMC
- Mieloablación de ratones NOD/SCID mediante ciclofosfamida: determinación de las dosis óptimas
- Compre ratones hembra diabéticos/con inmunodeficiencia combinada grave (NOD/SCID) no obesos (6-8 semanas).
nota: Todos los ratones que participaron en este estudio eran hembras.
- Preparar ciclofosfamida (PC) a diferentes dosis (50, 100 y 150 mg/kg) en solución salina. Preparar disulfiram (DS) al 0,8% Tween-80 en solución salina a 125 mg/kg.
NOTA: Se prepararon diferentes concentraciones de PC para permitir la administración de volúmenes iguales de solución de fármaco a ratones que recibieron diferentes dosis de PC.
- Tratar a los animales con PC (intraperitoneal, i.p.) y DS (peroral, p.o.) una vez al día durante 2 días. Administre DS (p.o.) 2 h después de cada dosis de CP.
NOTA: El SD disminuye la urotoxicidad de la PC en ratones, y se ha sugerido que la PC combinada con el SD produce neutropenia más duradera que los animales tratados con PC sola. Es posible que el régimen de dosis de PC deba determinarse previamente antes de los estudios reales y se encontró que varía ligeramente entre las diferentes cepas de ratones inmunodeficientes.
- Recoger muestras de sangre del seno venoso orbitario y transferirlas a tubos recubiertos de ácido etilendiaminotetraacético potásico (EDTA-K) en hielo el día 0 (1 h antes de la1ª dosis), el día 2 (24 h después de la 2ª dosis) y el día 4 (72 h después de la2ª dosis).
- Examinar el efecto de la mieloablación después del tratamiento con CP y DS mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Utilice el anti-ratón CD11b (M1/70), el antiratón Ly6C (HK1.4) y el Ly6G (1A8) antiratón para ratas para controlar CD11b + Ly6C alto como neutrófilos, CD11b + Ly6Calto como monocitos.
- Registre el peso corporal y las condiciones de salud de los ratones diariamente durante una semana. La dosis óptima de CP y DS se determina como el régimen que resulta en la máxima depleción de neutrófilos y monocitos sin causar toxicidad grave a los ratones.
- Trasplante de PBMC humano e injerto tumoral: configuración del modelo
- Aísle las PBMC humanas de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Tratar previamente a los ratones con CP y DS como se indica en los pasos 1.1.2 y 1.1.3 para aumentar la eficiencia del trasplante.
- De 20 a 24 h después de la segunda dosis de CP y DS, inyecte una línea celular tumoral humana como células A431 (ATCC, 2,5 x 106) y 5 x 106 PBMC aisladas (mezcladas en un total de 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene un 50% de Matrigel) o fragmentos tumorales (3 x 3 x 3 mm3, en un volumen total de 200 μL de PBS que contiene 50% de Matrigel) y 200 μL de 5 x 106 PBMCs (100 μL cada uno en el lado izquierdo y derecho del fragmento tumoral injertado) por vía subcutánea (s.c.) en el flanco derecho de los animales.
- Mida el volumen del tumor primario y regístrelo dos veces por semana durante 4-6 semanas.
nota: Los ratones serán sacrificados una vez que su peso corporal pierda más del 20% o su volumen tumoral alcance los 2.000mm3 o el tumor esté ulcerado.
- Sacrificar a los ratones en cámaras de gas con dióxido de carbono. Recoja los tejidos tumorales completos en ratones sacrificados con tijeras oftálmicas y procéselos para el análisis histológico e inmunohistoquímico (IHC). Examinar las expresiones humanas de CD8, PD-1 y PD-L1 en estos tejidos.
