Inhibición de la autofagia basada en siRNA en células dendríticas inmaduras infectadas por el virus del herpes simple

Resumen

Fuente: Düthorn, A., et al. siRNA Electroporación para modular la autofagia en células dendríticas derivadas de monocitos infectadas por el virus del herpes simple tipo 1. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra una técnica basada en ARN interferente pequeño (siRNA) para interferir con el flujo autofágico. Un siRNA dirigido al ARNm de FIP200 se introduce en células dendríticas inmaduras (iDC) derivadas de monocitos mediante electroporación, lo que provoca la eliminación de la expresión de FIP200 y conduce a la inhibición de la disrupción de la lámina nuclear mediante autofagia. Al agregar el virus del herpes simple (VHS), la salida nuclear de la progenie viral se inhibe debido a la ausencia de disrupción de la lámina a través del flujo autofágico.

Protocolo

Las CD derivadas de monocitos se generaron a partir de productos de leucoféresis de donantes sanos. Para ello, se ha obtenido el voto positivo del comité de ética local (número de referencia 4556). Los experimentos del presente estudio se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del comité de ética de la "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (número de referencia 4556). Todos los donantes aprobaron un consentimiento informado por escrito, incluido el de conformidad con la Declaración de Helsinki.

>1. Generación y manejo de células dendríticas inmaduras (iDCs) y células dendríticas maduras (mDCs)

1. Aislar células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de las cámaras del sistema de leucorreducción (LRSC) como se describió anteriormente. Evite la criopreservación de PBMC y utilícelas directamente después del aislamiento para obtener mayores rendimientos de CC.
2. Genere CD humanas a partir de PBMC de diferentes donantes sanos en matraces de cultivo celular T175 como se describió anteriormente. En resumen, use 350-400 millones de PBMC en 30 mL de medio DC (RPMI 1640 sin L-glutamina, 1% (v/v) de suero humano tipo AB (suero AB), 100 U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 0,4 mM de L-glutamina, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetinasulfónico (HEPES)) por matraz de cultivo celular para el aislamiento de monocitos por adherencia. Después de 1 h, lavar la fracción no adherente con RPMI 1640. Añadir medio DC fresco suplementado con 800 U/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y 250 U/mL de interleucina-4 (IL-4), e incubar durante 3 días.
   1. En el día 3 después de la adherencia, agregue 5 mL de medio DC fresco que contenga GM-CSF e IL-4 con una concentración final de 400 U/mL y 250 U/mL por matraz de cultivo celular, respectivamente, para la diferenciación de DC.
   2. Para recolectar iDCs, enjuague suavemente los iDC poco adherentes del fondo del matraz de cultivo celular, el día 4 después de la adherencia. Repita este paso 2 veces. Para la generación de mDCs, añadir cóctel de maduración compuesto de la siguiente manera: GM-CSF (concentración final: 40 U/mL), IL-4 (concentración final: 250 U/mL), interleucina-6 (IL-6, concentración final: 1000 U/mL), Interleucina-1 beta (IL-1β, concentración final: 200 U/mL), Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α, concentración final: 10 ng/mL), prostaglandina E2 (PGE2; concentración final: 1 μg/mL).
   3. Seis días después de la adherencia (dos días después de la inducción de la maduración con un cóctel de citoquinas), enjuague las mDC del fondo del matraz de cultivo celular. Repita este paso dos veces.
      nota: Las CD inmaduras y maduras se pueden generar secuencialmente a partir de donantes idénticos en 1 matraz de cultivo celular. Para ello, i) separar el número adecuado de iDC y ii) inducir la maduración de las células restantes en los matraces utilizando el cóctel de citocinas indicado en el paso 1.2.2.
3. Transfiera las iDC o mDC en el medio de cultivo celular respectivo a tubos de 50 mL. Recolectar las células mediante centrifugación a 300 x g durante 5 min.
   1. Resuspender suavemente (=lavar) las CD en 5-10 mL de RPMI 1640 por matraz de cultivo celular. Combine las suspensiones de CC respectivas en un tubo.
   2. Defina el número de celda utilizando una cámara de conteo o un método alternativo. Evite las alteraciones de la temperatura al manipular los iDC, para reducir el riesgo de cambios fenotípicos.

>2. Análisis de citometría de flujo para monitorizar el estado de maduración fenotípico

1. Transfiera las CCD o las CCD mC (0,5 x 10⁶) del paso 1.3.1 a un tubo de 1,5 ml. Recolectar las células mediante centrifugación a 3390 x g durante 1,5 min. Lave las células una vez con tampón FACS (PBS suplementado con suero fetal de ternero (FCS) al 2%).
2. Vuelva a suspender las células en 100 μL de solución de tinción de anticuerpos (tampón FACS) que contenga anticuerpos específicos marcados con fluorocromo contra moléculas de superficie definidas.
   1. Utilice los siguientes anticuerpos para verificar la pureza (CD3-isociocianato de fluoresceína [FITC], CD14-ficoeritrina [PE]), así como el estado de maduración de las CD (CD80-PacBlue [Pacific Blue]/-PE-cianinina5 [Cy5], CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).
   2. Prepare una muestra sin teñir en 100 μL de tampón FACS como control.
   3. Tiñe las celdas con hielo en la oscuridad durante 30 min.
3. A continuación, lavar las células dos veces en 1 ml de tampón FACS y centrifugar a 3390 x g durante 1,5 min.
4. Finalmente, resuspender las células en 200 μL de tampón FACS suplementado con paraformaldehído (PFA) al 2% y analizar las células mediante citometría de flujo. Las celdas fijas se pueden almacenar a 4 ° C en la oscuridad hasta 2 días.

>3. Interferencia del flujo autofágico inducido por HSV-1 a través de la electroporación de iDCs utilizando FIP200-siRNA

NOTA: El protocolo actual para la electroporación de siRNA fue modificado de Prechtel et al. (2007) y Gerer et al. (2017).

1. Transfiera los iDC (12 x 10,⁶) en el día 3,5 después de la adherencia a un tubo de 50 ml. Posteriormente, centrifugar las células a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Paralelamente, realice un análisis de citometría de flujo para controlar el estado de maduración como se describe en el paso 2 (use Life/Dead violet en lugar de CD80-PacBlue).
2. Lave suavemente los iDC en 5 mL de OptiMEM sin rojo de fenol y centrifugue las células a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente los iDC en 200 μL de OptiMEM sin rojo de fenol, ajustando una concentración celular de 6 x 10⁶/100 μL. No coloque las celdas sobre hielo y evite las alteraciones de temperatura. Avance rápidamente y evite largos períodos de incubación de iDC en OptiMEM sin rojo de fenol.
3. Transfiera 75 pmol de siRNA específico de FIP200 o 75 pmol de siRNA codificado, como control, a electrocubetas de 4 mm y agregue 100 μL (6x10⁶ celdas) de la suspensión celular. Pulse directamente las iDC utilizando el aparato de electroporación I, aplicando los siguientes ajustes: 500 V durante 1 ms.
   1. Antes del procedimiento experimental, prepare las suspensiones de siRNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante, alículas y guárdelas a -20 °C. Descongele y manténgalas en hielo cuando utilice estos siRNA para la electroporación. Antes de electroporar las muestras, realice un pulso de prueba.
4. Después de la electroporación, transfiera directamente iDC a placas de 6 pocillos con medio DC fresco precalentado (suplementado con 40 U/mL de GM-CSF y 250 U/mL de IL-4). Siembre las células a una concentración final de 1 x 10⁶/mL y colóquelas en una incubadora. No enjuague las celdas de la cubeta eléctrica.
5. Después de 48 h, primero examine la morfología de las iDC electroporadas microscópicamente. Luego, recoja las células con un raspador de células y transfiéralas a tubos de 15 ml. Enjuague los pocillos con 1 mL de PBS suplementado con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,01% y transfiera la solución en los tubos respectivos.
6. Posteriormente, divida 6 x 10⁶ iDC por condición de siRNA como se describe en los siguientes pasos.
   1. Utilice 0,5 x 10⁶ celdas para evaluar el estado de maduración y la viabilidad de la celda como se describe en el paso 2. Utilice los siguientes anticuerpos: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 y Violeta vivo/muerto.
   2. Utilice 1 x 10⁶ celdas para los análisis de Western blot a fin de verificar la eficiencia de derribo específica de FIP200. Transfiera y recoja las células en un tubo safelock de 1,5 ml por centrifugación a 3390 x g durante 1,5 min. Prepare lisados celulares y realice análisis de Western blot.
   3. Utilice las células restantes (4,5 x 10,⁶) para experimentos de infección por VHS-1. Para cada condición experimental, transfiera 2,25 x 10⁶ iDC a tubos de 2 mL e infórmelos con HSV1 en una multiplicidad de infección (MOI) de 2 o agregue tampón MNT como un control simulado. Realice la infección como se describe.
   4. A las 20 h después de la infección (hpi), recoja las células con un raspador de células y prepare los lisados celulares para los análisis de Western blot.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Unidad central 4D-Nucleofector (aparato de electroporación II)	Lonza (Basilea, Suiza)	AAF-1002B
Suero AB	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemania)	H4522	Cultivo de células dendríticas
ACD-A	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemania)	9007281
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (kit de electroporación aparato II)	Lonza (Basilea, Suiza)	V4XP-3024
Reactivo de detección de transferencia occidental Amersham ECL Prime	GE Healthcare (Solingen, Alemania)	RPN2232	Detección de Western Blot
Persulfato de amonio (APS)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemania)	A3678
anti-ratón-IgG (ratón, policlonal, HRP)	Cell Signaling (Leiden, Países Bajos)	7076	Detección de Western Blot
anti-conejo-IgG (cabra, policlonal, HRP)	Cell Signaling (Leiden, Países Bajos)	7074	Detección de Western Blot
Citómetro de flujo BD FACS Canto II	BD Biosciences (Heidelberg, Alemania)	338962
Cámara de secado Fastblot B44	Biometra (Göttingen, Alemania)	846-015-100
CCR7 (ratón, Pe-Cy7)	BioLegend (Fell, Alemania)	557648	Citometría de flujo Dilución: 1:100 Clon: G043H7
CD11c (ratón, Pe-Cy5)	BD Biosciences (Heidelberg, Alemania)	561692	Citometría de flujo Dilución: 1:100 Clon: B-ly6
CD14 (ratón, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Alemania)	555398	Citometría de flujo Dilución: 1:100 Clon: M5E2
CD3 (ratón, FITC)	BD Biosciences (Heidelberg, Alemania)	555332	Citometría de flujo Dilución: 1:100 Clon: UCHT1
CD80 (ratón, V450)	BD Biosciences (Heidelberg, Alemania)	560442	Citometría de flujo Dilución: 1:100 Clon: L307.4
CD83 (ratón, APC)	eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Alemania)	17-0839-41	Citometría de flujo Dilución: 1:200 Clon: HB15e
CD86 (ratón, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Alemania)	553692	Citometría de flujo Dilución: 1:100
Imágenes celulares EVOS FL	Sistema AMG/Life Technologies (Carlsbad, EE. UU.)	AMF4300
FIP200 (conejo)	Cell Signaling (Leiden, Países Bajos)	12436	Detección de Western Blot Dilución: 1:1000 Clon: D10D11
Aparato Gene Pulsser II (aparato de electroporación I)	BioRad Laboratories GmbH (Múnich, Alemania)	165-2112
GM-CSF (4x104 U/mL)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania)	130-093-868
HLA-DR (ratón, APC-Cy7)	BioLegend (Fell, Alemania)	307618	Citometría de flujo Dilución: 1:200 Clon: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43	BioVex		Infección de DC
IL-1β (0,1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Friburgo, Alemania)	1411-050
IL-4 (1x106 U/mL)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania)	130-093-924
IL-6 (1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Friburgo, Alemania)	1404-050
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare (Solingen, Alemania)	28955810
L-glutamina	Lonza (Basilea, Suiza)	17-605E
Kit de tinción de células muertas LIVE/DEAD Fixable Violet	Life Technologies (Carlsbad, CA, EE. UU.)	L34964	Tinción L/D en citometría de flujo
Linfopp	Alere Technologies AS (Oslo, Noruega)	04-03-9391/01
Cloruro de magnesio	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemania)	A537.1
Megafuge 2.0 RS	Heraeus (Hanau, Alemania)	75015505
Cámara de recuento Neubauer	Marca (Wertheim, Alemania)	717805
Matraces de cultivo celular Nunc (175.0 cm2)	Thermo Scientific (Rockford, EE. UU.)	159910
Paraformaldehído, 16 %	Alfa Aesar, Haverhill, Estados Unidos	43368.9M
PerfectSpin 24 Plus	Peqlab (Erlangen, Alemania)	C2500-R-PL
PGE2 (1 mg/mL)	Pfizer (Berlín, Alemania)	BE130681
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Lonza (Basilea, Suiza)	17-512F
Tampón de eliminación de Western Blot RestoreTM	Thermo Scientific, Rockford, EE. UU.	21059
Plataforma mecedora wt 15	Biometra (Göttingen, Alemania)	042-590
RotiBlock	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemania)	A151.4
Roti-Load 1 (4x)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemania)	K929.3
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemania)	3029.1
RPMI 1640	Lonza (Basilea, Suiza)	12-167F
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemania)	Artículo 2326.2
Thermomixer comfort	Eppendorf (Hamburgo, Alemania)	5355 000.011
TNF-α (10 μg/mL)	Peprotech (Hamburgo, Alemania)	300-01A
Tris	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemania)	4855.3
Solución de azul de tripano (0,4 %)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemania)	T8154
Preadolescente 20	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemania)	9127.1
Membrana de nitrocelulosa Whatman de 0,2 μm	GE Healthcare (Solingen, Alemania)	10600001
WhatmanTM Papel de cromatografía 3 mm Chr	Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Alemania)	3030917